L'anticorps SIRPα associé au virus oncolytique OH2 protège contre les tumeurs en activant l'immunité innée et en reprogrammant le microenvironnement immunitaire tumoral

BMC Medicine volume 20, Numéro d'article : 376 (2022) Citer cet article

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La combinaison de virus oncolytiques (VO) avec des blocages de points de contrôle immunitaires est un point chaud de la recherche et a montré une bonne efficacité. Nous présentons ici la première tentative de combiner le virus oncolytique de l'herpès simplex 2 (OH2) avec un anticorps anti-SIRPα comme traitement antitumoral. Nos résultats fournissent un aperçu unique de la combinaison de l'immunité innée avec OV.

Nous avons vérifié la polarisation et l'activation de OH2 dans les cellules RAW264.7 in vitro. Par la suite, nous avons évalué la capacité antitumorale de la thérapie combinée OH2 et anti-SIRPα dans un modèle de souris porteuse de tumeur. RNA-seq et Single-cell RNA-seq ont été utilisés pour caractériser les changements dans le microenvironnement tumoral.

Les lysats OH2 ont efficacement stimulé la polarisation des cellules RAW264.7 vers le phénotype M1 mais pas vers le phénotype M2 et ont activé la fonction du phénotype M1 in vitro. Dans l'expérience de clairance des macrophages, la thérapie OH2 a induit la polarisation des macrophages M1 et a participé à la réponse immunitaire antitumorale dans un modèle de souris porteuse de tumeur. Le traitement avec une combinaison d'OH2 et d'anti-SIRPα a efficacement inhibé la croissance tumorale et prolongé de manière significative le temps de survie des souris, et ce résultat était plus évident dans le modèle de souris avec un volume tumoral plus important au début du traitement. Ces résultats suggèrent que la thérapie combinée peut remodeler plus profondément le TME et activer des réponses immunitaires innées et adaptatives plus fortes.

Nos données confirment la faisabilité de la thérapie virale oncolytique en association avec des anticorps anti-SIRPα et suggèrent une nouvelle stratégie pour la thérapie virale oncolytique.

Rapports d'examen par les pairs

L'utilisation de virus pour le traitement du cancer a commencé il y a plus d'un siècle. Avec le développement du génie génétique et les avancées dans la compréhension du mécanisme d'action des virus, les virus oncolytiques (VO) pourraient devenir une plateforme thérapeutique idéale. Un nombre croissant d'études ont montré que l'effet destructeur des OV sur les cellules tumorales ne se fait pas seulement via une activité cytolytique directe mais implique également un mode de régulation complexe combinant de multiples mécanismes [1]. Ces mécanismes comprennent la régulation des changements dans le micro- et macroenvironnement tumoral, les réponses immunitaires spécifiques médiées par les lymphocytes T CD8 + et les réponses immunitaires cellulaires immunitaires innées [2,3,4]. Malgré leurs multiples mécanismes d'activité thérapeutique, de nombreuses études précliniques et cliniques ont montré que la plupart des virus oncolytiques, qu'ils soient armés ou non, montrent une efficacité limitée en monothérapie [5, 6]. La capacité des virus oncolytiques à modifier le microenvironnement tumoral (TME) et à altérer les tumeurs immunologiquement "froides" suggère qu'une combinaison de virus oncolytiques avec d'autres thérapies, telles que l'immunothérapie ou la chimiothérapie, peut obtenir de meilleurs résultats thérapeutiques [7, 8].

À l'heure actuelle, la combinaison des OV et du blocage des points de contrôle immunitaires (ICB) est un point chaud de la recherche et a montré une bonne efficacité dans certains essais cliniques [9]. Cependant, la combinaison des OV et de l'immunothérapie se concentre principalement sur la régulation des cellules T, et il existe peu d'études sur son effet sur l'immunité innée. Les OV favorisent la mort cellulaire immunogène (ICD) pendant la lyse cellulaire, recrutant et activant ainsi les cellules immunitaires innées telles que les macrophages et les cellules dendritiques par la libération de modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP) et de modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et favorisant davantage la activation des cellules T spécifiques de la tumeur dans le TME [4, 10]. Par conséquent, l'activation des cellules myéloïdes pour activer la destruction des tumeurs et améliorer la présentation de l'antigène pour activer la fonction immunitaire endogène devrait fournir des informations uniques pour la thérapie antitumorale.

Les macrophages sont une classe de cellules immunitaires hautement plastiques avec une variété de fonctions qui sont généralement divisées en macrophages M1 et macrophages M2 activés de manière classique en fonction de leur état de polarisation [11]. Les macrophages M1 favorisent la réponse inflammatoire Th1 par la libération de cytokines inflammatoires et améliorent encore la réponse des lymphocytes T par la régulation positive de la présentation de l'antigène et l'expression de molécules costimulatrices [11, 12]. Par conséquent, les macrophages M1 peuvent être impliqués dans l'immunité antitumorale dans le microenvironnement tumoral. Les macrophages M2 sont généralement associés à l'inhibition de l'immunité antitumorale endogène. La réduction du nombre de macrophages M2 et l'augmentation du nombre de macrophages M1 sont des conditions préalables importantes pour une thérapie tumorale réussie. De plus, la fonction phagocytaire des macrophages est régulée par l'axe antiphagocytaire CD47-SIRPα [13]. Le CD47 inhibe la phagocytose des macrophages grâce à une forte expression sur les cellules tumorales [13, 14]. L'anti-phagocytose de l'axe CD47-SIRPα peut être bloquée par des anticorps, augmentant ainsi la phagocytose des macrophages. Une étude récente a montré que le blocage de SIRPα sur les macrophages peut activer efficacement la capacité antitumorale des macrophages [15].

Dans des études antérieures [16, 17], nous avons constaté que le traitement par le virus oncolytique de l'herpès simplex 2 (OH2) peut modifier efficacement le TME et induire une réponse immunitaire antitumorale chez la souris. Dans cette étude, nous avons traité un modèle de tumeur de souris avec une combinaison d'OH2 et d'un anticorps anti-SIRPα. Nous avons analysé l'effet thérapeutique et l'état d'activation immunitaire de la thérapie combinée. Nos résultats suggèrent que l'OH2 combiné à l'activation des macrophages est une thérapie antitumorale prometteuse.

Les lignées cellulaires CT26, MC38, 4T-1 et RAW264.7 ont été achetées auprès de la National Infrastructure of Cell Line Resource (Pékin, Chine) et conservées par notre laboratoire. Les cellules ont été cultivées dans un incubateur à température constante contenant 5 % de CO2 à 37°C.

OH2 a été fourni par Binhui Biopharmaceutical Co., Ltd. (Wuhan, Chine). Le virus était un OH2 atténué dérivé de la souche HG52 du HSV-2 de type sauvage délété le gène ICP47 et le gène ICP34.5 [18, 19].

Les lignées cellulaires CT26, MC38 et 4T-1 en phase de croissance logarithmique ont été passées dans des boîtes de culture de 10 cm2 lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, rincez les cellules avec du PBS, puis ajoutez 5 ml de milieu RPMI-1640 sans sérum. (HyClone, Waltham, MA) et infecter les cellules avec OH2 selon MOI = 1, et ajouter 5 ml de milieu RPMI1640 contenant 10 % de FBS (Gibco, Waltham, MA) après 1 h. Après 30 h, le surnageant cellulaire a été collecté, centrifugé à 4°C, 400 g pendant 5 min, et le lysat a été collecté et stocké à -80°C pour une utilisation ultérieure. Le surnageant acellulaire (CFS) de CT26, 4T-1, MC38 et RAW264.7 non traité ont été utilisés comme contrôle. Le CFS de CT26, 4T-1 et MC38 a été obtenu à partir du surnageant de culture de cellules en phase de croissance logarithmique, centrifugé à 4°C, 400g pendant 5 min. Le surnageant du lysat de cellules CT26, MC38 et 4T1 préparé par congélation et décongélation répétées a également été utilisé comme groupe témoin.

Les cellules RAW264.7 en phase de croissance logarithmique ont été étalées sur une plaque 96 puits à 2000 cellules/puits et cultivées pendant plus de 6 h. Une fois que les cellules ont adhéré, le lysat et les contrôles ont été ajoutés aux cellules, et la détection du kit de comptage de cellules-8 (CCK8) a été effectuée aux moments correspondants (0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h) ( Dojindo, Kumamoto, Japon). Avant la détection, 100 μl de solution de travail de détection (réactif CCK8 : milieu RPMI1640 = 1:10) ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 dans l'obscurité. Enfin, un lecteur de microplaques (Bio-Rad, Japon) a été utilisé pour détecter l'absorbance des cellules à une longueur d'onde de 450 nm.

Les cellules RAW264.7 en phase de croissance logarithmique ont été étalées sur une plaque à 6 puits à raison de 106 cellules/puits. Après au moins 6 h, les cellules étaient complètement fixées à la paroi, et le lysat et le contrôle ont été ajoutés séparément. Après 24 h de traitement, les cellules RAW264.7 ont été colorées avec FITC anti-souris F4/80 (clone : FJK-16s, Invitrogen, Waltham, Massachusetts), APC anti-souris CD86 (clone : GL-1, Biolegend, San Diego , CA) et PE anti-souris CD206 (clone : MR6F3, Invitrogen, Waltham, Massachusetts) selon le protocole des anticorps (macrophage M1 : F4/80+CD86+, macrophage M2 : F4/80+CD206+) et soumis à un flux cytométrie (LSR II, BD). La détection de SIRPα sur les macrophages dans la rate de souris a utilisé FITC anti-souris F4/80, APC anti-souris CD11b (clone : M1/70, Biolegend, San Diego, CA) et PE anti-souris SIRPα (clone : P84, Biolegend , San Diego, Californie). Toute la cytométrie en flux utilisée pour détecter le typage des macrophages dans cette étude a été mise en place avec un groupe témoin d'isotype d'anticorps (PE Rat IgG2a, clone : RTK2758, Biolegend, États-Unis ; APC Rat IgG2a, clone : RTK2758, Biolegend, États-Unis ; FITC Rat IgG2a, clone : RTK2758, Biolégende, États-Unis).

Les lignées cellulaires CT26, MC38 et 4T-1 en phase de croissance logarithmique ont été digérées et remises en suspension à une concentration de 1 × 106/mL. Un μL de solution de travail CFSE (C34554, Life Technology, Waltham, MA) (0,5 mM) a été ajouté à chaque 2 ml de cellules tumorales avec une concentration de 1 × 106/mL et incubé à 37°C (5% CO2) pendant 8 min. Après l'incubation, 10 ml de milieu RPMI 1640 pré-refroidi contenant 10 % de FBS ont été ajoutés pour arrêter la coloration. Le surnageant a été éliminé par centrifugation et la concentration cellulaire a été ajustée à 5 x 105/mL avec du milieu RPMI 1640 avec 10 % de FBS. La concentration de 264.7 brut traité avec le lysat et le contrôle a été ajustée à 5 x 106/mL. Avec le rapport de 25: 1, 50: 1 et 100: 1 en tant qu'échantillons parallèles de rapport effecteur à cible, la co-culture a été effectuée dans une plaque de puits en forme de U à 96 puits, 100 μL de cellules raw264.7 et 100 μL des cellules tumorales ont été ajoutées à chaque puits, et 3 échantillons parallèles ont été mis en place. Place ensuite la plaque de culture à 37°C (5% CO2) pendant 4h. Avant le test, 200 μL de solution de travail PI (P8080, Solarbio, Pékin, Chine) (2,5 μg/mL) ont été ajoutés à chaque puits de culture.

Les lignées cellulaires CT26, MC38 et 4T-1 et les macrophages de la rate de souris ont été colorés avec APC anti-souris CD47 (clone : miap301, Biolegend, San Diego, CA), anti-souris SIRPα purifié (clone : P84, Biolegend , San Diego, CA) et des anticorps anti-souris IgG-Alexa 488 (ab150113, Abcam, Cambridge, UK) selon le protocole des anticorps. Les niveaux d'expression de CD47 et SIRPα ont été détectés par cytométrie en flux.

Les coupes de tissu incluses en paraffine ont été cuites à 60–65 ° C pendant plus de 6 h, puis placées dans du xylène pour le déparaffinage à chaud. Les étapes ont été suivies d'une hydratation en gradient d'éthanol, d'un antigène de réparation de citrate (ZLI 9064, Zsjqbio, Pékin, Chine), d'un peroxyde d'hydrogène à 3 % bloquant l'activité de la peroxydase endogène, d'un blocage (SP-KIT-B2, MXB, Fujian, Chine), d'un anticorps primaire F480 ( clone : SP115, dilution : 1:200, Abcam, Cambridge, UK), CD86 (clone : E5 W6H, dilution : 1:500, CST, Danvers, Massachusetts), CD206 (polyclonal, dilution : 1:100, Abcam, Cambridge , Royaume-Uni), CD8 (polyclonal, dilution : 1:200, Affinity Biosciences, Jiangsu, Chine), CD16 (polyclonal, dilution : 1:200, Affinity Biosciences, Jiangsu, Chine) et anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) ( Kit-5010, MXB, Fujian, Chine), visualisé avec le chromogène 3,30-diaminobenzidine DAB (DAB-1031, MXB, Fujian, Chine), coloration à l'hématoxyline (Solarbio, Pékin, Chine), différenciation de l'acide chlorhydrique et de l'éthanol, et l'eau ammoniacale redevient bleue. Enfin, après déshydratation avec un gradient d'éthanol, les coupes de tissu ont été déshydratées dans du xylène et scellées avec de la gomme neutre. Après séchage, des coupes de tissu ont été observées pour la coloration au microscope (Nikon Eclip se 80i, Japon).

Les coupes de tissu incluses en paraffine ont été cuites à 60°C-65°C pendant plus de 6 h, puis placées dans du xylène pour déparaffinage à chaud. Après hydratation en gradient d'éthanol et immersion dans le formol neutre, chaque anticorps coloré a été séquentiellement réparé par du citrate, bloqué par du sérum de chèvre et incubé avec des anticorps primaires contre F480 (clone : SP115, dilution : 1 : 500, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), CD86 ( clone : E5 W6H, dilution : 1:1000, CST, Danvers, Massachusetts), CD206 (polyclonal, dilution : 1:200, Abcam, Cambridge, UK), CD8 (polyclonal, dilution : 1:500, Affinity Biosciences, Jiangsu, Chine), CD16 (polyclonal, dilution : 1:500, Affinity Biosciences, Jiangsu, Chine) et anticorps secondaire, et coloré par fluorescence pour amplifier le signal. Une fois la coloration terminée, la solution de travail DAPI a été ajoutée goutte à goutte, et enfin, la tablette de montage super anti-trempe a été ajoutée à la monture comme requis par les instructions du kit (TSA-RM, PANOVUE, Pékin, Chine). Les tranches de tissu colorées ont été scannées et analysées avec les logiciels Plaris et Inform.

Les images IHC ont été numérisées à l'aide du logiciel CaseViewer2.4. Le degré de coloration a été noté : les cellules avec une coloration <10 % ont été notées comme une coloration négative (-, 1), les cellules avec une coloration de 10 à 49 % ont été notées comme (+, 2) ; les cellules avec un taux de coloration de 50 à 74 % ont été notées (++, 3), 75 à 100 % des cellules colorées ont été notées (+++, 4). Les scores de plage positive de coloration sont les suivants : incolore (0) ; particules jaune pâle (1), particules tan (2) et particules brunes (3). Le score final a été défini comme le score d'étendue de la coloration multiplié par le score de plage de coloration positive [20]. Les scores d'expression négatifs variaient de 0 à 5, avec des scores d'expression positifs supérieurs à 5 [21].

Les souris ont été achetées auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.). Des souris Balb/c femelles âgées de 6 à 8 semaines pesant environ 19 à 20 g ont été maintenues dans un rack ultrapropre à flux laminaire dans notre animalerie dans des conditions aseptiques spécifiques pendant environ 1 semaine. Chaque souris a été inoculée par voie sous-cutanée (sc) avec 3 x 105 cellules CT26 sur le côté droit de la zone dorsale. La tumeur est apparue après environ 5 à 7 jours et le traitement a été administré lorsque le diamètre de la tumeur a atteint 3 à 5 mm ou 8 à 10 mm.

Toutes les opérations ont été réalisées selon les procédures opératoires normalisées du système de gestion de l'élevage expérimental de souris sans pathogènes spécifiques (SPF) spécifié par l'État. Toutes les procédures expérimentales liées aux animaux ont été approuvées par le Comité d'éthique des expérimentations animales du National Cancer Center/Cancer Hospital, de l'Académie chinoise des sciences médicales (CAMS) et du Peking Union Medical College.

Un modèle tumoral de transplantation sous-cutanée de cellules CT26 a été construit. Lorsque le diamètre de la tumeur a atteint 3 à 5 mm (jour 7), les souris du modèle CL ont été séparées en trois groupes (OH2 [OH2 + Liposomes témoins], OH2 + CL et groupe témoin PBS) avec une distribution uniforme de volumes tumoraux. Attribué plus de 10 souris à chaque groupe. L'OH2 (2 x 106 unités formant plaque [PFU]) a été réalisée par injection intratumorale (it) au jour 0, au jour 2 et au jour 4 dans un volume de 100 μl. Cent microlitres de CL (7 mg/mL, F70101C-NC, FormuMax, Sunnyvale, CA) ou de liposomes témoins (7 mg/mL, F70101-N, FormuMax, Sunnyvale, CA) par souris ont été administrés par injection intrapéritonéale (ip) la veille du traitement OH2. Le groupe témoin PBS a reçu 100 μL de PBS par souris. La croissance tumorale a été régulièrement observée et enregistrée pour chaque groupe de souris. Après 14 jours de traitement, les tissus tumoraux ont été réséqués pour une coloration immunohistochimique et immunohistochimique multicolore. Les souris du groupe d'observation de la survie étaient à nouveau porteuses de tumeurs le 40e jour.

Un modèle tumoral de transplantation sous-cutanée de cellules CT26 a été construit. Lorsque le diamètre de la tumeur atteignait 3 à 5 mm (jour 7), il était défini comme la tumeur étant plus petite au moment du traitement initial. Les souris du modèle anti-SIRPα avec des tumeurs plus petites au traitement initial ont été séparées en six groupes (groupe OH2 + anticorps anti-SIRPα, groupe OH2 + isotype, groupe OH2, groupe anticorps anti-SIRPα, groupe isotype et groupe témoin PBS) avec une répartition homogène des volumes tumoraux. Attribué plus de 10 souris à chaque groupe. Le traitement OH2 ou PBS a été injecté aux jours 0, jour 2 et jour 4, et l'anticorps anti-SIRPα (clone : P84, Bioxcell, Liban, New Hampshire) ou isotype (TNP6A7, Bioxcell, Liban, New Hampshire) a été administré aux jours 1 et 3. L'anticorps anti-SIRPα et l'isotype ont été injectés par voie intrapéritonéale (ip) avec 100 μg, dilués à 1 mg/ml avec du PBS sans solution de conservation et injectés 100 μL par voie intrapéritonéale pour chaque souris. Le groupe témoin PBS a reçu 100 μL de PBS par souris. La méthode d'administration et le dosage de l'OH2 étaient les mêmes que ceux du modèle CL. La croissance tumorale des souris a été observée et enregistrée régulièrement tous les deux jours.

Lorsque le diamètre de la tumeur atteignait 8 à 10 mm (jour 14), il était défini comme la tumeur étant plus grosse au moment du traitement initial. Les souris du modèle anti-SIRPα avec des tumeurs plus grosses au traitement initial ont été séparées en quatre groupes (groupe d'anticorps anti-SIRPα OH2+, groupe d'isotype OH2+, groupe OH2, groupe d'anticorps anti-SIRPα et groupe témoin PBS) avec une distribution uniforme des volumes tumoraux. Attribué plus de 10 souris à chaque groupe. Le mode d'administration et la stratégie de traitement étaient les mêmes que ceux décrits ci-dessus. La croissance tumorale des souris a été observée et enregistrée régulièrement. Après 12 jours de traitement, les tissus tumoraux ont été réséqués pour une coloration immunohistochimique, immunohistochimique multicolore et un séquençage d'ARN.

Lorsque le point final expérimental ou le point final humanitaire a été atteint, par exemple lorsque la taille de la souris a atteint 2500 mm3 ou que des métastases tumorales ou une croissance rapide ont provoqué une ulcération, une nécrose ou une infection gênant l'alimentation ou la marche, les souris ont été anesthésiées avec 5% d'hydrate de chloral puis sacrifié par dislocation cervicale. La formule de calcul du volume tumoral était volume = (longueur × largeur2)/2.

Le séquençage du transcriptome impliqué dans cette étude a été entrepris et complété par Tianjin Nuohe Zhiyuan Bioinformation Technology Co., Ltd. Des échantillons d'ARN devaient atteindre un volume total de ≥ 30 μL, un volume total de ≥ 1,5 μg et une concentration de ≥ 50 ng/μL. La méthode de quantification par électrophorèse sur gel d'agarose, Nanodrop et Agilent 2100 ont été utilisées pour tester la concentration, la pureté et l'intégrité de l'ARN soumis. Le type de construction de bibliothèque était une bibliothèque spécifique de chaîne eucaryote. La stratégie de séquençage était Illumina Hiseq-PE150 (séquençage bidirectionnel).

Les tissus tumoraux du groupe témoin, du groupe OH2 et du groupe de traitement combiné ont été soumis à une analyse de séquençage unicellulaire, et la technologie de séquençage unicellulaire utilisée dans cette étude a été fournie par Huada Company. Le tissu a été dissocié à l'aide du kit de dissociation tumorale (souris, MACS), les cellules mortes ont été éliminées et la suspension unicellulaire de cellules vivantes a été laissée pour le séquençage. Les données obtenues ont été analysées à l'aide du progiciel Seurat et le tracé du volcan a été tracé à l'aide du progiciel R EnhancedVolcano. Les packages R utilisés pour l'analyse GO et l'analyse KEGG comprenaient tidyverse, patchwork, monocle, clusterProfiler, org.Mm.eg.db.

La version 4.0.2 du logiciel R a été utilisée pour analyser les données de séquençage du transcriptome, et le progiciel R "edgeR" a été utilisé pour l'analyse de l'expression différentielle entre les groupes. L'analyse d'enrichissement d'ensemble de gènes (GSEA) a été utilisée pour étudier les voies de signal de différence entre différents groupes. Le progiciel R "clusterProfiler" a été utilisé pour l'analyse Gene Ontology (GO) et Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). L'analyse de la variation de l'ensemble de gènes (GSVA) ​​a été utilisée pour l'analyse de l'infiltration des cellules immunitaires. Le test t de Student a été utilisé pour comparer les gènes différentiellement exprimés, et la valeur P a été ajustée et corrigée par la méthode de Benjamini-Hochberg. Le changement de facteur log2 était supérieur à 1 et la valeur P corrigée était inférieure à 0,01 comme seuil pour juger de la signification de la différence. Un total de 770 gènes de souris liés à l'immunologie créés à partir du nCounter Mouse PanCancer Immune Profiling Panel (NanoString) ont été utilisés comme gènes de référence qui sont répertoriés dans le fichier supplémentaire 1 : tableau S1 et le fichier supplémentaire 2 : tableau S2.

La version 8 du logiciel GraphPad Prism a été utilisée pour l'analyse statistique et les différences statistiquement significatives ont été définies comme une valeur p<0,05. Le test t de Student bilatéral non apparié a été utilisé pour comparer deux groupes. Une analyse de variance à deux voies (ANOVA) a été réalisée sur les données expérimentales pour les volumes de tumeurs pour plus de deux groupes. La méthode de Kaplan-Meier et le test du log-rank ont ​​été utilisés pour les données de la courbe de survie ; la période de survie a été définie comme le temps écoulé entre le début du traitement et la fin de l'observation. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM. Dans cette étude, toutes les expériences ont été répétées au moins trois fois, à l'exception des parties indiquées autrement.

Nous avons confirmé le rôle des macrophages dans le processus de traitement par OH2 du cancer du côlon, comme le montre la figure 1A. Comme le montre la figure 1B, les cellules RAW264.7 traitées avec les lysats avaient une viabilité et une capacité de prolifération significativement améliorées par le test CCK8 (p <0, 0001 pour les cellules CT26 et MC38, p = 0, 001 et p <0, 0001 par rapport au surnageant sans cellule (CFS) et cellules RAW264.7 et 4T-1 non traitées, respectivement). Les lysats ont stimulé l'activation des macrophages. Nous avons également incubé OH2 à différents MOI (MOI = 1, MOI = 0, 5) avec des cellules RAW264.7 pour déterminer si OH pouvait activer directement les macrophages via CCK8. Comme prévu, l'ajout d'OH2 (fichier supplémentaire 3 : Fig. S1) ou de lysat cellulaire congelé (fichier supplémentaire 3 : Fig. S2) n'a pas pu activer les macrophages directement dans les 24 h.

Les lysats OH2 induisent la polarisation et la phagocytose RAW264.7 in vitro. Un schéma de la préparation du lysat et un organigramme de l'expérience réalisée dans l'étude. Résultats du test de prolifération cellulaire B des lignées cellulaires CT26 (à gauche), MC38 (au milieu) et 4T-1 (à droite) traitées avec le lysat (rouge), le SCF (bleu) et le groupe non traité (noir) par le test CCK8 en 24 h. C Résultats de l'analyse par cytométrie en flux d'un échantillon représentatif de chaque lignée cellulaire avec traitement au lysat ou au CFS. D Le pourcentage de sous-type M1 (F4/80+CD86+) dans le lysat, le CFS et les groupes non traités de cellules CT26, MC38 et 4T-1 détectés par cytométrie en flux. Les données sont des moyennes de trois échantillons par groupe de traitement. Un test t de Student non apparié a été utilisé pour analyser la signification de la différence entre les deux groupes et une ANOVA a été utilisée pour analyser la signification de la différence entre les groupes (>2). E Le rapport du sous-type M2 (F4/80+CD206+) dans le lysat, le CFS et les groupes non traités de cellules CT26, MC38 et 4T-1 détectés par cytométrie en flux. Les données sont des moyennes de trois échantillons par groupe de traitement. Un test t de Student non apparié a été utilisé pour analyser la signification de la différence entre les groupes. F. Les fonctions phagocytaires et tueuses des macrophages traités avec différents lysats de cellules cancéreuses détectés par CFSE/PI. Trois ratios effecteurs/cibles ont été définis pour chaque lignée cellulaire (RAW264.7 : cellules tumorales = 25 : 1, 50 : 1 et 100 : 1). Les données sont des moyennes de trois échantillons par groupe de traitement. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de l'ANOVA avec comparaisons multiples. ns, aucune différence significative, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001

Par la suite, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour détecter le rapport des macrophages M1 (F4/80 + CD86 +) et M2 (F4/80 + CD206 +) après traitement au lysat (Fig. 1C). La proportion de macrophages M1 après le traitement au lysat et au SFC a augmenté de manière significative (p=0,0015, p<0,0001 et p<0,0001 pour le traitement au lysat CT26, MC38 et 4T-1, respectivement, et p=0,01, p=0,0073 et p= 0,023 pour le traitement CT26, MC38 et 4T-1 CFS, respectivement) par rapport au groupe non traité (Fig. 1D). Il y avait également des différences significatives entre les lysats et le traitement au SFC (p = 0, 01, p = 0, 0018 et p <0, 0001 pour le traitement au lysat CT26, MC38 et 4T-1, respectivement). Fait intéressant, il n'y avait pas de différence dans la proportion de macrophages M2 entre le lysat et les groupes non traités, mais la proportion de macrophages M2 dans le SFC a augmenté de manière significative par rapport à celle des deux autres groupes (Fig. 1E, Fichier supplémentaire 3 : Fig. S3 ). Le rapport des macrophages M1 (F4/80+CD86+) et M2 (F4/80+CD206+) dans les cellules RAW264.7 traitées avec le lysat dans le groupe SIRPα bloqué et le groupe SIRPα non bloqué n'était pas significativement différent (p=0,010, Fichier supplémentaire 3 : fig. S4). La différence de polarisation RAW264.7 induite par le lysat cellulaire congelé et le CFS n'était pas statistiquement significative (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S5). Des résultats similaires ont également été observés dans les macrophages primaires spléniques de souris. Le SFC n'a pas modifié de manière significative la proportion de M1 ou de M2, tandis que la proportion de M1 et de M2 ​​dans les macrophages primaires a augmenté de manière significative après le traitement au lysat (p <0, 0001). Bien que le lysat cellulaire congelé ait également augmenté la proportion de M1, cela se reflétait davantage dans la proportion de M2 ​​(Fichier supplémentaire 3 : Fig. S6). Ces résultats ont indiqué que les lysats stimulaient efficacement la polarisation des macrophages vers le phénotype M1 mais pas vers le phénotype M2. Pour découvrir la relation entre la polarisation des macrophages et la phagocytose, un test de destruction cellulaire a été effectué. Il n'y avait pas de différences significatives entre le SFC et les groupes non traités. Les macrophages M1 polarisés par le lysat avaient un effet destructeur significatif par rapport aux deux autres groupes, et l'effet était renforcé par une augmentation du rapport cellules effectrices: cellules cibles (E: T) (Fig. 1F).

Pour explorer les changements dans les macrophages avec polarisation, le séquençage de l'ARN a été effectué sur différents groupes de traitement RAW264.7. Que les lysats CT26 aient été comparés au surnageant ou aux cellules RAW264.7 non traitées, l'analyse GO a montré que les lysats activaient l'activité des voies de signalisation antivirales dans les cellules RAW264.7, y compris la réponse au virus, la régulation du processus viral, la régulation de la réponse immunitaire innée et réponse à l'interféron-bêta (Fig. 2A et B). L'analyse KEGG a montré les mêmes changements de signalisation que le traitement au lysat (Fig. 2C et D). De plus, la GSEA a montré que les voies liées à l'interféron étaient régulées à la hausse et que les voies de signalisation liées à la prolifération cellulaire étaient régulées à la baisse après le traitement au lysat (Fig. 2E). Par rapport au groupe surnageant, l'expression des marqueurs M1 (Il23a, Il6, Nfkb1, Cd80, Il27, Ccl5, Cd86, Il21r, Il33, Ccl6, Cxcl10, Il7, Cxcl11, Il18, Ccl7, Tlr4 et Ccl2) dans le lysat groupe de traitement a été régulé à la hausse et l'expression des marqueurs M2 (Stat3, Mr1 et Ncan) a été régulée à la baisse (Fig. 2F et G). Ces résultats suggèrent que le traitement au lysat pourrait induire efficacement la polarisation des macrophages M1, activer la fonction des macrophages M1 et activer les réponses immunitaires antivirales et antitumorales.

Le séquençage de l'ARN des groupes traités au lysat, traités au SFC et non traités a caractérisé la fonction Raw264.7. Une analyse GO de gènes différentiellement exprimés de cellules RAW264.7 traitées avec du lysat et du SFC. Analyse B GO de gènes différentiellement exprimés de cellules RAW264.7 traitées avec un lysat et de cellules RAW264.7 non traitées. Analyse C KEGG de gènes différentiellement exprimés de cellules RAW264.7 traitées avec du lysat et du SFC. Analyse D KEGG de gènes différentiellement exprimés de cellules RAW264.7 traitées avec un lysat et de cellules RAW264.7 non traitées. E GSEA de gènes différentiellement exprimés de cellules RAW264.7 traitées avec du lysat et du SCF. F L'expression des marqueurs macrophages M1 dans les cellules RAW264.7 traitées avec le lysat et le CFS. G L'expression des marqueurs macrophages M2 dans les cellules RAW264.7 traitées avec le lysat et le CFS. La couleur représente la valeur du niveau d'expression du gène dans le séquençage de l'ARN

Nous avons exploré la corrélation entre le traitement OH2 et la fonction des macrophages in vivo, comme le montre la figure 3A. Sur la base de recherches antérieures [16], nous avons montré que la thérapie OH2 favorisait l'infiltration de cellules immunitaires adaptatives (cellules T) et de cellules immunitaires innées (macrophages, DC et cellules NK) (Fig. 3B).

Le traitement à l'OH2 a polarisé les macrophages vers le phénotype M1 pour tuer les tumeurs in vivo. A Le processus de traitement et la chronologie de l'expérience du modèle animal CL. B Les résultats de l'analyse de l'infiltration des cellules immunitaires du groupe de traitement OH2 et du groupe témoin par GSVA. C La courbe de croissance tumorale du groupe CL combiné OH2 (rouge), du groupe OH2 (OH2 avec liposomes témoins) (bleu) et du groupe témoin (noir). La boîte rouge a zoomé (à droite) pour montrer le groupe CL combiné OH2 et le groupe OH2. Une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) a été effectuée sur les données expérimentales. n=10 souris/groupe, ****, P<0,0001. D La courbe de survie du groupe CL combiné OH2 (rouge), du groupe OH2 (bleu) et du groupe témoin (noir). La méthode de Kaplan-Meier et le test du log-rank ont ​​été utilisés pour les données de la courbe de survie. ns, pas de différences significatives. E Résultats M-IHC représentatifs du groupe OH2 (à gauche) et du groupe CL combiné OH2 (à droite). F4/80, vert, CD86, violet et CD206, jaune. Barre d'échelle, 100 μm. Résultats de quantification F M-IHC pour le sous-type M1. n=3 échantillons/groupe. Le test t de Student a été utilisé pour analyser la signification de la différence entre les deux groupes. ***, p<0,001. G Résultats de quantification M-IHC pour le sous-type M2. n=3 échantillons/groupe. Le test t de Student a été utilisé pour analyser la signification de la différence entre les deux groupes. **, p<0,01. H Coloration IHC représentative pour CD86 (à gauche), CD206 (au milieu) et F4/80 (à droite) dans le groupe CL combiné OH2 (en haut) et OH2 (en bas). Grossissement d'origine, ×200. n=5 échantillons/groupe. (Le pourcentage représentait la proportion de macrophages M1/M2 dans le nombre total de cellules). I. Résultats quantitatifs de la coloration de CD86 dans le groupe OH2 combiné CL et OH2. J Résultats quantitatifs de la coloration de CD206 dans le groupe OH2 combiné CL et OH2. K Résultats quantitatifs de la coloration F4/80 dans le groupe OH2 combiné CL et OH2. n=3 échantillons/groupe. Le test t de Student a été utilisé pour analyser la signification de la différence entre les deux groupes. ns, aucune différence significative, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001

Les macrophages des souris porteuses de CT26 ont été éliminés à l'aide de liposomes de clodronate (CL) un jour avant le traitement. Tout d'abord, nous avons vérifié l'efficacité de la clairance et constaté qu'elle atteignait plus de 90 % dans les 24 h suivant l'injection, puis qu'elle s'était rétablie et qu'elle était supérieure au niveau de préinjection 72 h plus tard (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S7). Ces résultats suggèrent que l'utilisation de CL seul peut éliminer efficacement tous les macrophages existants sans affecter la formation de nouveaux macrophages.

Comme le montre la figure 3C, la thérapie OH2 et la CL combinées à la thérapie OH2 ont montré une forte inhibition tumorale. En effet, la thérapie combinée a montré une suppression tumorale plus précoce et un effet thérapeutique plus significatif (p<0,0001) (Fig. 3C). Cependant, il n'y avait pas de différence de survie entre les deux groupes et toutes les tumeurs des groupes combinés et OH2 ont finalement régressé (Fig. 3D). L'expérience de rechallenge a montré que le taux de formation de tumeurs du groupe combiné était significativement inférieur à celui du groupe OV (p = 0,029), bien que les tumeurs soient finalement revenues (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S8). Cela implique que les macrophages pourraient jouer un rôle dans l'effet thérapeutique de l'OH2.

L'analyse quantitative par immunohistochimie multicolore (M-IHC) a montré que l'utilisation combinée de CL et OH2 favorisait une augmentation des macrophages M1 (p=0,0004) dans le microenvironnement immunitaire tumoral, accompagnée d'une diminution des macrophages M2 (p=0,0011) par rapport à OH2 seul (Fig. 3E–G, Fichier complémentaire 3 : Fig. S9). Les résultats d'immunohistochimie ont montré que le marqueur macrophage M1 était fortement exprimé dans les tissus tumoraux et que le marqueur macrophage M2 n'était exprimé qu'à de faibles niveaux dans le groupe de thérapie combinée (Fig. 3H – K). Ces résultats suggèrent que la thérapie OH2 peut induire la polarisation des macrophages M1 et participer à la réponse immunitaire antitumorale in vivo.

Pour explorer davantage la faisabilité de l'OH2 combiné à la thérapie par macrophages, un anticorps anti-SIRPα qui bloque l'axe CD47-SIRPα dans les macrophages a été utilisé. Tout d'abord, nous avons détecté l'expression de CD47 et de SIRPα dans des lignées cellulaires. Comme le montre la figure 4A, CD47 était largement exprimé dans la plupart des lignées cellulaires, tandis que l'expression de SIRPα était spécifique à la lignée cellulaire. Le niveau d'expression de SIRPα sur les macrophages dans la rate de souris a été montré dans le fichier supplémentaire 3 : Fig. S10. Ces résultats suggèrent que nous pourrions supprimer l'effet bloquant de CD47 sur la phagocytose des macrophages avec un anticorps anti-SIRPα.

La combinaison de la thérapie OH2 et anti-SIRPα améliore les réponses immunitaires anticancéreuses in vivo. A Les niveaux d'expression de CD47 et de SIRPα dans les lignées cellulaires CT26, MC38 et 4T-1 ont été détectés par cytométrie en flux. B Le processus de traitement et le calendrier expérimental pour le traitement combiné ajusté. C La courbe de croissance tumorale de différents groupes de traitement de souris porteuses de tumeurs avec des volumes tumoraux plus importants lors du traitement initial. La boîte rouge a zoomé pour montrer le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, l'isotype combiné OH2 et le groupe OH2. Une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) a été effectuée sur les données expérimentales. n = 10 souris/groupe. *, p=0,019. D La courbe de survie de différents groupes de traitement de souris porteuses de tumeurs avec des volumes tumoraux plus importants lors du traitement initial. La méthode de Kaplan-Meier et le test du log-rank ont ​​été utilisés pour les données de la courbe de survie. *, p=0,041. E La courbe de croissance tumorale du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, du groupe d'anticorps anti-SIRPα, du groupe OH2 et du groupe témoin. Une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) a été effectuée sur les données expérimentales. n = 6 souris/groupe. * ; **. F La courbe de survie du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, du groupe d'anticorps anti-SIRPα, du groupe OH2 et du groupe témoin. La méthode de Kaplan-Meier et le test du log-rank ont ​​été utilisés pour les données de la courbe de survie. *, p=0,0183. G Le processus de traitement et le calendrier expérimental pour le traitement combiné. H La courbe de croissance tumorale du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, de l'isotype combiné OH2 et du groupe témoin. Une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) a été effectuée sur les données expérimentales. n = 7 souris/groupe. *, p=0,029 ; **, P=0,0041 ; ***, p=0,0003. I La courbe de survie du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, de l'isotype combiné OH2 et du groupe témoin. La méthode de Kaplan-Meier et le test du log-rank ont ​​été utilisés pour les données de la courbe de survie. *, p=0,03 et p=0,018 ; **, P=0,0014

Un test in vivo a été réalisé. Lorsque le volume tumoral CT26 était faible en début de traitement (45,315±4,403 mm3), le volume tumoral et la survie n'étaient pas significativement différents entre le groupe de traitement combiné et le groupe de traitement OH2 (p=0,4712) (Fichier complémentaire 3 : Fig. S11). Que ce soit en traitement unique ou combiné, OH2 pourrait exercer une excellente efficacité antitumorale, et la tumeur finirait par régresser complètement. Ensuite, nous avons ajusté l'expérience in vivo (Fig. 4B). Nous avons commencé le traitement au jour 14 lorsque la tumeur était plus grosse (281,596 ± 31,469 mm3) et qu'une différence d'efficacité entre le groupe de traitement OV et le groupe de traitement combiné a commencé à apparaître (Fig. 4C). Par rapport aux autres groupes, les tumeurs du groupe de traitement combiné ont régressé plus rapidement. De plus, les souris du groupe combiné avaient un taux de survie plus élevé (P = 0, 041) que les souris des groupes OH2 et OH2 + iIsotype (Fig. 4D). Le nombre de souris ayant obtenu une régression tumorale était également le plus élevé. Par rapport au groupe témoin, les deux groupes utilisant OH2 ont pu inhiber efficacement la croissance tumorale et prolonger la survie des souris (Fig. 4E, F). Cependant, l'anticorps anti-SIRPα seul n'a pas inhibé la croissance tumorale (P> 0, 05, Fig. 4E) ni prolongé le temps de survie des souris porteuses de tumeurs ( P> 0, 05, Fig. 4F).

Nous avons également vérifié l'exclusion immunitaire dans des modèles de souris 4T-1 (Fig. 4G). Comme le montre la figure 4H, le groupe de combinaison a montré un puissant effet antitumoral qui était significativement différent du groupe OH2 (p = 0,0041) et du groupe témoin (p = 0,003). De plus, les souris du groupe combiné avaient un meilleur taux de survie que les souris des groupes OH2 (p = 0, 03) et témoin (p = 0, 0014) (Fig. 4I). Ces résultats ont montré que les anticorps anti-SIRPα augmentaient l'efficacité de la thérapie OH2.

Par la suite, nous avons effectué une analyse pathologique du tissu tumoral des souris. Les résultats anatomopathologiques ont montré que dans le microenvironnement tumoral des souris n'ayant pas reçu de traitement, la proportion de macrophages M2 était bien supérieure à celle des macrophages M1 (Fig. 5A, Fichier complémentaire 3 : Fig. S12). Le traitement avec OH2 a réduit l'infiltration des macrophages M2 (p <0, 001) et a augmenté dans une certaine mesure l'infiltration des cellules NK (p <0, 05) dans le microenvironnement tumoral (Fig. 5B et C). L'utilisation combinée d'anticorps anti-SIRPα et d'OH2 a entraîné une infiltration accrue de lymphocytes T CD8 (p <0, 01) et de macrophages M1 (p <0, 001) dans le microenvironnement tumoral (Fig. 5D et E). Les résultats d'immunohistochimie ont montré que les cellules immunitaires du groupe de traitement combiné étaient concentrées dans la partie centrale de la tumeur (Fig. 5F, G et Fichier supplémentaire 3 : Fig. S13). Cela impliquait que la capacité de ces cellules immunitaires inhibant les tumeurs à migrer vers le centre de la tumeur était renforcée. Ces résultats suggèrent que la thérapie combinée peut stimuler une réponse immunitaire antitumorale plus forte que le traitement seul.

Coloration M-IHC et IHC du modèle de traitement par anticorps anti-SIRPα. A Les résultats M-IHC représentatifs du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, de l'isotype combiné OH2, du groupe OH2 et du groupe témoin avec un volume tumoral plus important ont satisfait au traitement initial. CD8, vert, CD16, bleu ciel, F4/80, violet, CD86, orange et CD206, rouge. Barre d'échelle, 100 μm. B Résultats quantitatifs de la coloration des cellules NK (CD16) dans le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, l'isotype combiné OH2, le groupe OH2 et le groupe témoin. n=3 échantillons/groupe. C Résultat quantitatif de la coloration du macrophage M2 (F4/80+CD206+) dans le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, l'isotype combiné OH2, le groupe OH2 et le groupe témoin. n=3 échantillons/groupe. D Résultats quantitatifs de la coloration du macrophage M1 (F4/80+CD86+) dans le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, l'isotype combiné OH2, le groupe OH2 et le groupe témoin. n=3 échantillons/groupe. E Résultats quantitatifs de la coloration des lymphocytes T CD8 dans le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, l'isotype combiné OH2, le groupe OH2 et le groupe témoin. n=3 échantillons/groupe. F Coloration IHC représentative pour CD8, CD16, F4/80, CD86 et CD206 du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, du groupe isotype combiné OH2, du groupe OH2 et du groupe témoin avec des volumes tumoraux plus importants lors du traitement initial. Grossissement d'origine, ×200. n=5 échantillons/groupe. G Résultats quantitatifs de la coloration CD8, CD16, F4/80, CD86 et CD206 dans le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, l'isotype combiné OH2, le groupe OH2 et le groupe témoin. n=5 échantillons/groupe. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de l'ANOVA avec comparaisons multiples. ns, aucune différence significative, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001 (la proportion représente le pourcentage de la cellule par rapport au nombre total de cellules)

Nous avons utilisé le séquençage d'ARN et le séquençage à ARN unique pour caractériser plus en détail le TME. Le traitement à l'OH2 seul peut favoriser l'infiltration de cellules immunitaires adaptatives (cellules T et cellules Th1) et de cellules immunitaires innées (macrophages et DC) dans le microenvironnement immunitaire tumoral (Fig. 6A). Dans le groupe de thérapie combinée, les scores de macrophages étaient beaucoup plus élevés. Bien qu'il n'y ait pas eu de différence significative, les CD, les CD8 + et la cytotoxicité ont été améliorés par la combinaison par rapport au traitement à l'OH2 seul (Fig. 6B). Lorsque les anti-SIRPα et OH2 étaient combinés, ils étaient plus propices à l'infiltration de cellules immunitaires dans les tissus tumoraux, en particulier les macrophages, les DC, les cellules T et les cellules NK. Les cellules immunitaires ont été globalement activées, créant ainsi un microenvironnement tumoral antitumoral (Fig. 6C). À la suite de l'infiltration de cellules immunitaires, le signal de présentation de l'antigène dans les tumeurs du groupe de traitement combiné a été amélioré et la fonction de destruction des cellules immunitaires a été renforcée (Fig. 6D et Fichier supplémentaire 3 : Fig. S14). Cependant, la capacité de prolifération des cellules tumorales a diminué et l'apoptose a augmenté (Fig. 6C, Fichier supplémentaire 3 : Fig. S15). L'analyse GO a montré que la migration des leucocytes et la chimiotaxie étaient améliorées dans le groupe de traitement combiné, conformément aux résultats de l'IHC (Fig. 6E et F). La capacité de migration accrue et l'activation fonctionnelle des cellules immunitaires dans les tissus tumoraux, ainsi que l'activation complète des cytokines liées à M1, des cytokines liées aux cellules T et des cytokines liées aux NK, ont favorisé l'élimination des cellules tumorales (Fig. 6G – I ). Ces résultats suggèrent que la thérapie combinée peut remodeler plus profondément le TME et activer des réponses immunitaires innées et adaptatives plus fortes.

Le microenvironnement immunitaire tumoral révélé par le séquençage de l'ARN résulte des tissus tumoraux dans différents groupes de traitement. A Les résultats de l'analyse de l'infiltration des cellules immunitaires des tissus tumoraux du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, du groupe OH2 et du groupe témoin par GSVA. B Les résultats de notation des cellules immunitaires (macrophages, DC, cellules Th1, cellules Th2, cellules T, cellules T CD8, cellules NK CD56bright et cellules cytotoxiques) des tissus tumoraux du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, du groupe OH2 et groupe de contrôle par GSVA. C Les voies de signalisation liées au système immunitaire des tissus tumoraux du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, du groupe OH2 et du groupe témoin par GSVA. D Les résultats de notation des voies de signalisation liées au système immunitaire (interféron, activité des cellules NK, cytotoxicité, amorçage et activation des cellules T, localisation des cellules immunitaires aux tumeurs, signalisation des cytokines et des chimiokines) des tissus tumoraux du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2 , groupe OH2 et groupe témoin par GSVA. Analyse E GO des gènes exprimés de manière différentielle dans le groupe témoin et le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2. Analyse F GO des gènes différentiellement exprimés dans le groupe OH2 et le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2. G Le niveau d'expression des cytokines liées à M1 dans le groupe OH2, OH2 combiné avec le groupe d'anticorps anti-SIRPα et le groupe témoin. H Les niveaux d'expression des cytokines liées aux lymphocytes T dans le groupe OH2, et OH2 combiné avec le groupe d'anticorps anti-SIRPα et le groupe témoin. I Le niveau d'expression des cytokines liées aux NK dans le groupe OH2, OH2 combiné avec le groupe d'anticorps anti-SIRPα et le groupe témoin. Un test t de Student non apparié a été utilisé pour analyser la signification de la différence entre les deux groupes. ns, aucune différence significative, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. La couleur représente la valeur du niveau d'expression du gène dans le séquençage de l'ARN. OH2 + SIRPα représente l'OH2 combiné avec le groupe d'anticorps anti-SIRPα

Les données unicellulaires ont montré que les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral pouvaient être divisées en cellules T, cellules B, cellules NK, cellules myéloïdes, mastocytes et cellules DC (Fig. 7A et fichier supplémentaire 3 : Fig. S16). La proportion de chaque sous-ensemble de cellules immunitaires est représentée sur la figure 7B. Par rapport au groupe témoin, les cellules T, les cellules NK et les cellules DC du groupe OH2 et du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2 ont augmenté, tandis que les cellules myéloïdes ont diminué. Par rapport au groupe traité avec OH2 seul, les cellules NK et les cellules DC ont été significativement augmentées dans le groupe de traitement combiné, et les cellules myéloïdes ont été significativement diminuées (Fig. 7B). L'analyse des différents types de macrophages a montré que (Fig. 7C) les macrophages M1 étaient augmentés dans les deux groupes traités avec OH2, mais l'augmentation des macrophages M1 était plus significative dans le groupe de traitement combiné (Fig. 7D). Les gènes différentiellement exprimés entre le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2 et les deux autres groupes ont été identifiés. Des fragments d'acide nucléique viral, des protéines de capside intactes non conditionnées ou des contenus cellulaires peuvent être impliqués dans le traitement en tant que PAMP/DAMP. Les résultats des données de séquençage unicellulaire ont montré que Tlr2 et Tlr13 sont régulés positivement (Fig. 7E). Tlr2 et Tlr13 reconnaissent les composants du virus et activent les voies de signalisation dépendantes du récepteur de type Toll (TLR) [22, 23], et la fonction des cellules immunitaires a été fortement activée (Fig. 7F).

Le microenvironnement immunitaire tumoral révélé par le séquençage à ARN unique se traduit par des tissus tumoraux dans différents groupes de traitement. A Regroupement de cellules immunitaires dans des données unicellulaires. B Proportions de différents sous-ensembles de cellules immunitaires dans les données unicellulaires. C Regroupement de macrophages dans des données unicellulaires. D Proportions de différents sous-ensembles de macrophages dans les données unicellulaires. Diagramme E Volcano montrant des récepteurs de type péage dans des gènes exprimés de manière différentielle dans le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2. Analyse F GO des gènes différentiellement exprimés dans le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2

Pour vérifier la réponse des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques à la tumeur du traitement, les lymphocytes spléniques isolés de différents groupes de traitement (témoin, anti-SIRPα, OH2 et OH2+ anti-SIRPα) ont été co-cultivés avec des cellules CT26 in vitro à la cible rapports cellule/cellule effectrice (T:E) de 1:100, 1:50 et 1:25. Les lymphocytes du groupe OH2 et du groupe OH2+ anti-SIRPα ont montré une réponse CTL hautement spécifique contre les cellules CT26 (p<0,001). La réponse CTL de OH2 combiné à l'anticorps anti-SIRPα était plus intense que celle de OH2 seul (p<0,05). Cependant, aucune réponse CTL n'a été détectée avec l'anticorps anti-SIRPα seul (fichier supplémentaire 3 : Fig. S17A). ELISA a été utilisé pour détecter le surnageant des cellules co-cultivées, et nous avons trouvé que l'expression de TNF-α, Granzyme B et IFN-γ pouvait être significativement induite dans le groupe OH2 et le groupe OH2+anti-SIRPα (p<0,0001 , Fichier complémentaire 3 : Fig. S17B). Dans l'ensemble, les cytokines effectrices des cellules T étaient légèrement plus élevées dans le groupe OH2 + anti-SIRPα que dans le groupe OH2, bien qu'il n'y ait pas de différence statistique. De plus, les cytokines effectrices des lymphocytes T n'ont pas été détectées avec l'anticorps anti-SIRPα seul. Ces résultats suggèrent que la thérapie combinée peut également améliorer les CTL spécifiques à la tumeur.

Nous rapportons l'efficacité et les effets moléculaires et immunologiques d'une thérapie combinée avec le virus de l'herpès simplex oncolytique et un anti-SIRPα dans un modèle murin in vitro et in vivo (Fig. 8). Nous avons démontré que l'OH2 induite par le lysat de cellules tumorales peut activer et induire efficacement la différenciation des macrophages RAW264.7 de souris vers le phénotype M1, améliorant leur phagocytose et leurs effets destructeurs sur les cellules tumorales in vitro. Nous avons observé que la combinaison d'OH2 et d'anti-SIRPα, qui bloque l'axe CD47-SIRPα, peut effectivement renforcer l'effet thérapeutique en renforçant l'effet immunitaire inné des macrophages. La combinaison d'OH2 et d'anti-SIRPα a également montré une régulation plus forte du microenvironnement immunitaire tumoral.

Le traitement à l'OH2 a polarisé les macrophages vers M1 pour tuer les tumeurs in vivo, et l'anticorps SIRPα combiné à la thérapie à l'OH2 remodèle le TME et active une réponse immunitaire anti-tumorale plus complète. L'introduction de l'anticorps SIRPα peut accélérer la reconstitution cellulaire du TME et induire une réponse immunitaire antitumorale spécifique par une réponse immunitaire innée plus précoce

Ces dernières années, les OV ont été considérés comme une nouvelle stratégie prometteuse pour le traitement du cancer. Par rapport à la thérapie chirurgicale, à la chimioradiothérapie et à la thérapie ciblée, les VO ont montré une capacité de destruction élevée, une capacité de ciblage précise et peu d'effets secondaires ou de résistance aux médicaments [9, 24, 25]. Les OV peuvent être génétiquement modifiés pour améliorer leur capacité de ciblage tumoral, améliorer leur sécurité et augmenter leur efficacité antitumorale [26, 27]. Plus de 40 types d'OV sont actuellement évalués dans des essais cliniques pour le traitement de diverses tumeurs, dont la plupart sont en phase I [24], mais seul T-VEC est entré avec succès dans des essais cliniques de phase III et a reçu l'autorisation de mise sur le marché [28] .

L'OH2 utilisé dans la présente étude a montré une bonne tolérance à l'injection intratumorale et une activité antitumorale persistante chez les patients atteints d'un cancer métastatique de l'œsophage et du rectum dans une étude récente [29]. Bien qu'un grand nombre d'essais cliniques aient montré des résultats positifs avec les VO, leur efficacité en tant qu'agents de monothérapie est limitée [6, 30, 31]. Par conséquent, la thérapie combinée est l'une des stratégies utilisées pour améliorer l'effet thérapeutique des VO [32, 33].

Le mécanisme par lequel OV tue les tumeurs comprend l'infection et la réplication dans les cellules tumorales, conduisant à la lyse ou à l'apoptose des cellules tumorales, et un mécanisme plus important est que les cellules tumorales tuées libèrent des antigènes liés à la tumeur pour obtenir une réponse immunitaire spécifique à la tumeur améliorée. [34]. Étant donné que la thérapie OV peut induire une réponse immunitaire antitumorale adaptative, une combinaison d'inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI) et d'OV pourrait avoir une valeur clinique potentielle. Certaines études ont montré que l'OV associée aux inhibiteurs de CTLA-4 ou aux inhibiteurs de PD-1 améliore la réponse antitumorale et améliore significativement la survie des patients, aussi bien dans les études précliniques que dans les essais cliniques [2, 35,36,37,38]. Actuellement, 19 essais cliniques sont en cours sur la thérapie combinée ICI et OV, montrant que la thérapie combinée est devenue l'un des points chauds des options de traitement clinique OV [39].

Cependant, la thérapie combinée existante se concentre davantage sur la réponse immunitaire adaptative et moins sur l'immunité innée. Lorsque les OV lysent les cellules tumorales, ils libèrent de nombreuses cytokines, des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et des modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), qui activent les réponses immunitaires innées. Nos données ont montré que le lysat de OH2 après infection par des cellules tumorales pouvait stimuler efficacement l'activation de la lignée de macrophages de souris RAW264.7 et la polarisation de type M1 in vitro. Bien que les résultats du séquençage de l'ARN aient montré que les cellules RAW264.7 avaient une forte réponse immunitaire antivirale, les cellules RAW264.7 polarisées de type M1 ont également montré une capacité de destruction spécifique à la tumeur dans des expériences ultérieures. Saha et al. [40] ont montré que l'ICI combiné à l'OV prolongeait modestement la survie d'un modèle de gliome de souris, qui était associé à un afflux de macrophages et à une polarisation de type M1. Ces résultats suggèrent que les OV combinés aux cellules immunitaires innées, telles que les macrophages et les cellules dendritiques, ont également une valeur d'application potentielle.

Des études récentes ont montré que l'axe CD47-SIRPα est un point de contrôle phagocytaire régulant les macrophages et d'autres cellules immunitaires innées, et une série de molécules qui bloquent l'axe CD47-SIRPα sont en développement clinique pour le traitement des tumeurs [13, 41]. Certains groupes de recherche ont conçu oHSV1 exprimant un anticorps CD47 de pleine longueur, qui a atteint une bonne efficacité thérapeutique dans des modèles murins de cancer de l'ovaire métastatique et de glioblastome [42, 43]. Yao et al. [44] ont rapporté l'effet antitumoral d'un nouvel adénovirus oncolytique contenant le gène de fusion SIRPα-IgG1 Fc dans le cancer CD47-positif. Étant donné que CD47 est couramment exprimé à des niveaux élevés dans les tissus normaux, le ciblage spécifique des cellules tumorales via CD47 est discutable [45]. SIRPα est fortement exprimé dans les cellules de la moelle osseuse telles que les macrophages et les CD, mais est exprimé à de faibles niveaux dans d'autres cellules immunitaires. Par conséquent, SIRPα peut être une cible plus idéale pour l'axe CD47-SIRPα [45, 46]. Dans cette étude, nous avons démontré que la thérapie virale oncolytique pouvait recruter et activer efficacement les macrophages in vivo et induire une polarisation de type M1, démontrant la faisabilité du blocage des VO en combinaison avec le blocage de l'axe CD47-SIRPα. La combinaison d'anticorps OH2 et anti-SIRPα a eu un effet significatif sur le traitement du modèle CT-26 de cancer colorectal de souris. Fait intéressant, nous avons constaté que la thérapie combinée était plus efficace chez les souris avec des volumes tumoraux initiaux plus importants. Cela peut être dû au nombre de monocytes infiltrés dans le microenvironnement tumoral avec l'augmentation de la taille de la tumeur, et le traitement par virus oncolytique a fait passer le microenvironnement tumoral du "froid" au "chaud", induisant ainsi la génération de macrophages de type M1 plus abondants. Ces résultats suggèrent également que l'effet thérapeutique peut être encore amélioré en optimisant les différents temps de dosage de la thérapie combinée.

Avec une meilleure compréhension du microenvironnement immunitaire tumoral, l'immunothérapie à base de macrophages devient une réalité [47]. Les macrophages sont des régulateurs importants de nombreux aspects du TME et peuvent activer des réponses immunitaires spécifiques à la tumeur directement ou par des effets non spécifiques sur les fonctions des cellules T et B [12, 48, 49]. Nous avons également observé que la thérapie OV seule ou en combinaison avec l'anticorps SIRPα recrutait un grand nombre de cellules NK et de monocytes pour déclencher des réponses immunitaires innées, ce qui est cohérent avec les conclusions de Ramelyte et al. [50]. Les macrophages jouent un rôle important dans la limitation de l'infection par le HSV [51, 52], et les résultats du séquençage unicellulaire ont montré l'activation des voies de signalisation TLR impliquées dans le groupe de traitement combiné. Nous avons observé que la thérapie combinée n'a pas produit de réponse antivirale significative par rapport au traitement seul, cependant, les macrophages sont plus susceptibles d'activer l'état immunitaire global. Les résultats suggèrent que la polythérapie induit une destruction plus spécifique des cellules tumorales. Les caractéristiques de la thérapie combinée aux niveaux cellulaire et moléculaire reposent sur la reconstruction rapide de l'environnement immunitaire au sein du TME et sur l'activation complète et continue de l'immunité innée et adaptative. L'efficacité de la thérapie combinée est due à de multiples synergies immunitaires, et non à un seul type de cellule immunitaire. Les macrophages peuvent jouer un rôle dans la présentation précoce de l'antigène et une réponse immunitaire élargie.

En conclusion, nos données confirment la faisabilité d'une thérapie virale oncolytique en association avec un anticorps anti-SIRPα. L'introduction de l'anticorps anti-SIRPα peut accélérer la reconstitution cellulaire du TME et induire une réponse immunitaire antitumorale spécifique par une réponse immunitaire innée plus précoce. Notre étude suggère une nouvelle stratégie pour la thérapie virale oncolytique.

Les données associées à cette étude sont présentes dans l'article ou les documents supplémentaires. Les données RNA-seq sont également disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

Signal régulateur protéine-alpha

Virus de l'herpès simplex oncolytique 2

Virus oncolytique

Séquençage de l'ARN

Environnement du microenvironnement tumoral

Blocage des points de contrôle immunitaire

Mort cellulaire immunogène

Modèles moléculaires associés aux dommages

Modèles moléculaires associés aux agents pathogènes

Surnageant acellulaire

Kit de comptage de cellules-8

Ontologie des gènes

Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes

Analyse d'enrichissement d'ensembles de gènes

Liposomes de clodronate

Immunohistochimique multicolore

Immunohistochimique

Sans pathogène spécifique

Récepteur de type péage

Lymphocyte T cytotoxique

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Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences de Chine (n° 82001758) et le programme clé de recherche et de développement de la province du Hubei (2020BCA062).

State Key Laboratory of Molecular Oncology, Department of Etiology and Carcinogenesis, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing, 100021, Chine

Defeng Kong, Zhenrong Yang, Guoliang Li, Quanyou Wu, Zhaoru Gu, Duo Wan, Qi Zhang, Xiaoli Zhang, Shujun Cheng et Kaitai Zhang

Centre national "111" pour la régulation cellulaire et la pharmacologie moléculaire, Laboratoire clé d'ingénierie de la fermentation (ministère de l'Éducation), Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation, College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan, 430068, Chine

Binlei Liu

Département d'immunologie, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing, 100021, Chine

Wen Zhang

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WZ, KTZ et DFK ont conçu les expériences. DFK a mené les expériences. DFK, WZ et QYW ont effectué le traitement des données et l'analyse statistique. DFK, WZ, KTZ et BLL ont rédigé, révisé et/ou révisé le manuscrit. ZRY, GLL, ZRG, SW, QZ, ZLZ et SJC ont fourni un soutien administratif, technique ou matériel (c'est-à-dire la préparation d'instruments chirurgicaux pour des expériences sur des animaux, la communication ou l'organisation de données et la construction de bases de données). WZ et KTZ ont supervisé l'étude. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Binlei Liu, Kaitai Zhang ou Wen Zhang.

Cette étude a été entièrement approuvée par le National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, l'Académie chinoise des sciences médicales et le Peking Union Medical College (NCC2020A308).

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

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Gène lis pour heatmap.

Liste des gènes GSVA.

Résultats du test de prolifération cellulaire. Résultats du test de prolifération cellulaire des lignées cellulaires Raw264.7 traitées avec OH2 MOI = 1 (rouge), OH2 MOI = 0,5 (bleu) et groupe non traité (noir) par test CCK8 en 72 heures. Figure S2. Les lysats OH2 induisent la polarisation et la phagocytose RAW264.7 in vitro. A. Démonstration de l'analyse de la phagocytose par cytométrie en flux. B. Résultats du test de prolifération cellulaire des lignées cellulaires CT26, MC38 et 4T-1 traitées avec le lysat (rouge), le CFS (bleu), le lysat congelé cellulaire (violet) et le groupe non traité (noir) par le test CCK8 en 24 heures. **, p<0,01. Figure S3. Le rapport des macrophages M1 (F4/80+CD86+) et M2 (F4/80+CD206+) dans RAW264.7 sans aucun traitement par cytométrie en flux. Figure S4. Le rapport des macrophages M1 (F4/80+CD86+) et M2 (F4/80+CD206+) dans RAW264.7 traité avec le lysat dans le groupe SIRPα bloqué et le groupe SIRPα non bloqué. A. Démonstration de l'analyse de la polarisation des macrophages par cytométrie en flux. B. Affichage des résultats du contrôle isotypique pour différents anticorps. C. Le rapport des macrophages M1 (F4/80+CD86+) et M2 (F4/80+CD206+) dans le groupe SIRPα bloqué et le groupe SIRPα non bloqué. D. Le rapport des macrophages M1 (F4/80+CD86+) et M2 (F4/80+CD206+) dans le groupe SIRPα bloqué et le groupe SIRPα non bloqué. Un test t de Student non apparié a été utilisé pour analyser la signification de la différence entre les deux groupes. Figure S5. Le lysat congelé cellulaire et le CFS induisent la polarisation RAW264.7 in vitro. A. Résultats de l'analyse par cytométrie en flux d'un échantillon représentatif de chaque lignée cellulaire. B. Le rapport du sous-type M1 (F4/80+CD86+) dans les groupes lysat congelé cellulaire et CFS de cellules CT26, MC38 et 4T-1 détectés par cytométrie en flux. Un test t de Student non apparié a été utilisé pour analyser la signification de la différence entre les deux groupes. Figure S6. Les lysats OH2 induisent la polarisation primaire des macrophages in vitro. A. Démonstration de l'analyse de la polarisation des macrophages par cytométrie en flux. B. Le pourcentage de sous-type M1 (F4/80+CD86+) et de sous-type M2 (F4/80+CD206+) dans les groupes de lysat, CFS, non traité et congelé cellulaire détectés par cytométrie en flux. Les données sont des moyennes de trois échantillons par groupe de traitement. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de l'ANOVA avec comparaisons multiples. ns, aucune différence significative, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. Figure S7. L'efficacité claire de CL détectée par cytométrie en flux. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de l'ANOVA avec comparaisons multiples. ***, p=0,0003 ; ****, p<0,0001. Figure S8. Rechallenge tumoral avec CT26 des animaux guéris OH2 ou OH2+ CL. A. La courbe de croissance tumorale des cellules CT26 rechallenge après que les tumeurs du modèle CL aient complètement régressé. B. Le taux tumorigène des souris rechallenge tumorales dans le groupe de liposomes témoins combinés OH2 et le groupe CL combiné OH2. Les différences statistiques ont été calculées à l'aide du test du Chi-carré. p=0,0291. Figure S9. M-IHC staning du groupe CL combiné OH2 (à gauche) et OH2 (à droite), y compris chaque marqueur de coloration unique. Figure S10. Niveau d'expression de SIRPα sur les macrophages dans la rate de souris détecté par cytométrie en flux. A. Mise en évidence du niveau d'expression de SIRPα sur des macrophages dans la rate de souris détecté par cytométrie en flux. B. Histogramme montrant le niveau d'expression de SIRPα sur les macrophages dans la rate de souris (n = 3). Figure S11. La thérapie anti-SIRPα combinée avec OH2 améliore les réponses immunitaires anticancéreuses dans un modèle de cancer CT26. A. Le processus de traitement et le calendrier expérimental pour le traitement combiné. B. La courbe de croissance tumorale de différents groupes de traitement de souris porteuses de tumeurs avec des volumes tumoraux plus petits lors du traitement initial. La boîte rouge a zoomé pour montrer le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, l'isotype combiné OH2 et le groupe OH2. Une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) a été effectuée sur les données expérimentales. n = 10 souris/groupe. ns, pas de différences significatives. C. La courbe de survie de différents groupes de traitement de souris porteuses de tumeurs avec des volumes tumoraux plus petits lors du traitement initial. La méthode de Kaplan-Meier et le test du log-rank ont ​​été utilisés pour les données de la courbe de survie. ns, pas de différences significatives. Figure S12. Résultats de la coloration M-IHC du modèle anti-SIRPα. Étalonnage M-IHC du groupe témoin (en haut à gauche), du groupe OH2 (en haut à droite), du groupe d'isotypes combinés OH2 (en bas à gauche) et du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2 (en bas à droite), y compris chaque marqueur de coloration unique. Figure S13. Coloration IHC et résultats quantitatifs du modèle de traitement par anticorps anti-SIRPα. A. Coloration IHC représentative pour CD8, F4/80, CD86 et CD206 du groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, du groupe témoin et du groupe d'anticorps anti-SIRPα avec des volumes tumoraux plus importants lors du traitement initial. B. Résultats quantitatifs de la coloration de CD8, F4/80, CD86 et CD206 dans le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2, le groupe témoin et le groupe d'anticorps anti-SIRPα. Grossissement d'origine, ×200. n=5 échantillons/groupe. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de l'ANOVA avec comparaisons multiples. ns, aucune différence significative, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. Figure S14. Résultats KEGG des tissus tumoraux du modèle anti-SIRPα. A. Résultats KEGG des gènes exprimés de manière différentielle entre le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2 et le groupe témoin. B. Résultats KEGG des gènes exprimés de manière différentielle entre le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2 et le groupe d'anticorps isotypes combinés OH2. Figure S15. Résultats GSEA des tissus tumoraux du modèle anti-SIRPα. A. Résultats GSEA des gènes exprimés de manière différentielle entre le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2 et le groupe témoin. B. Résultats GSEA des gènes exprimés de manière différentielle entre le groupe d'anticorps anti-SIRPα combinés OH2 et le groupe d'anticorps isotypes combinés oHSV-2. Figure S16. Analyse des données scRNA-seq. A. Les parcelles UMAP représentent les grappes (à gauche) et les groupes (à droite) de cellules tumorales. B. Une carte thermique montrant l'expression moyenne à l'échelle de chaque sous-groupe de cellules. C. Graphiques UMAP montrant les valeurs d'expression des gènes marqueurs canoniques de chaque sous-cluster. D. Une carte thermique montrant l'expression moyenne à l'échelle de chaque sous-groupe de cellules immunitaires. C. Graphiques UMAP montrant les valeurs d'expression des gènes marqueurs canoniques de chaque sous-cluster immunitaire. Figure S17. Essai CTL. A. Les fonctions de destruction des lymphocytes co-cultivés avec différents lysats de cellules cancéreuses détectés par CFSE/PI. Trois rapports effecteurs/cibles ont été définis pour chaque lignée cellulaire (lymphocytes : cellules tumorales = 25 : 1, 50 : 1 et 100 : 1). Les données sont des moyennes de trois échantillons par groupe de traitement. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de l'ANOVA avec comparaisons multiples. ns, aucune différence significative, *, p<0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001, ****, p<0,0001. B. Le surnageant du test CTL a été testé pour TNF-α, Granzyme B et IFN-γ par ELISA. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de l'ANOVA avec comparaisons multiples. ns, pas de différences significatives, ****, p<0,0001.

Méthodes supplémentaires.

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Réimpressions et autorisations

Kong, D., Yang, Z., Li, G. et al. L'anticorps SIRPα associé au virus oncolytique OH2 protège contre les tumeurs en activant l'immunité innée et en reprogrammant le microenvironnement immunitaire tumoral. BMC Med 20, 376 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02574-z

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Reçu : 09 mars 2022

Accepté : 21 septembre 2022

Publié: 31 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1186/s12916-022-02574-z

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