Découverte de deux nouvelles isoformes du gène DUT humain
Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7760 (2023) Citer cet article
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Dans les cellules humaines, deux isoformes de dUTPase ont été décrites : une nucléaire (DUT-N) et une mitochondriale (DUT-M), avec des signaux de localisation apparentés. En revanche, ici, nous avons identifié deux isoformes supplémentaires ; DUT-3 sans aucun signal de localisation et DUT-4 avec le même signal de localisation nucléaire que DUT-N. Sur la base d'une méthode RT-qPCR pour la quantification spécifique à l'isoforme simultanée, nous avons analysé les profils d'expression relatifs dans 20 lignées cellulaires humaines d'origines très différentes. Nous avons constaté que l'isoforme DUT-N est exprimée de loin au niveau le plus élevé, suivie par l'isoforme DUT-M et l'isoforme DUT-3. Une forte corrélation entre les niveaux d'expression de DUT-M et DUT-3 suggère que ces deux isoformes peuvent partager le même promoteur. Nous avons analysé l'effet de la privation de sérum sur l'expression des isoformes de dUTPase par rapport aux cellules non traitées et avons constaté que les niveaux d'ARNm de DUT-N diminuaient dans les cellules A-549 et MDA-MB-231, mais pas dans les cellules HeLa. De manière surprenante, lors de la privation de sérum, DUT-M et DUT-3 ont montré une augmentation significative de l'expression, tandis que le niveau d'expression de l'isoforme DUT-4 n'a montré aucun changement. Pris ensemble, nos résultats indiquent que l'approvisionnement en dUTPase cellulaire peut également être fourni dans le cytoplasme et que les changements d'expression induits par le stress de famine dépendent de la lignée cellulaire.
Les polymérases ne peuvent pas faire la distinction entre le dUTP et le dTTP car ils ne diffèrent que par un seul groupe méthyle. Par conséquent, le maintien du rapport dUTP/dTTP approprié est de la plus haute importance1. L'enzyme dUTPase est responsable de la préservation de l'intégrité du génome en catalysant l'hydrolyse du dUTP en dUMP et en pyrophosphate, éliminant ainsi le dUTP du pool de dNTP2,3. Si le dUTP est disponible, l'uracile incorporé est clivé par les uracile-ADN glycosylases dans le cadre du mécanisme de réparation par excision de base4. Un niveau élevé de dUTP peut entraîner une mort cellulaire sans thymine via la suractivation du processus de réparation de l'ADN5, pour éviter cela, l'activité de l'enzyme dUTPase est nécessaire. L'autre rôle de la réaction catalysée par la dUTPase est de produire du dUMP, qui est un substrat de la thymidylate synthase dans la voie de synthèse de novo du dTTP.
À ce jour, deux isoformes de dUTPase humaine ont été décrites dans la littérature, qui se localisent respectivement dans le noyau et dans la mitochondrie, vraisemblablement pour assurer la régulation du pool de dUTP dans ces deux organites contenant de l'ADN6. Les deux isoformes sont codées par le gène DUT et générées par l'utilisation d'un promoteur alternatif couplé à un épissage alternatif7,8. Les deux isoformes ne diffèrent que par le premier exon, car l'isoforme mitochondriale (DUT-M) contient une séquence de ciblage mitochondriale, tandis que l'isoforme nucléaire (DUT-N) contient un signal de localisation nucléaire7,9,10. Les deux isoformes de la dUTPase ont été décrites par Ladner et al. avec une analyse par Northern et Western blot aux niveaux de l'ARNm et des protéines, respectivement7. Les niveaux d'expression d'ARN des isoformes dans les fibroblastes pulmonaires humains 34Lu ont également été étudiés sous privation de sérum, ce qui oblige les cellules à sortir du cycle cellulaire et à entrer dans un état de repos. Selon Ladner et al., cette transition conduit à une diminution drastique de l'expression de l'isoforme DUT-N dUTPase, sans changement du niveau de l'isoforme DUT-M.
Des études récentes de séquençage à haut débit ont prédit la présence putative de deux isoformes supplémentaires chez l'homme, appelées DUT-3 (UniProt ID : A0A0C4DGL3, NCBI RefSeq ID : NM_001025249.1) et DUT-4 (UniProt ID : H0YNW5, NCBI RefSeq ID : NM_001330286.2) dans le présent ouvrage. Les bases de données de séquences suggèrent que la troisième isoforme suggérée (DUT-3) ne contient aucun signal de localisation, elle est donc très probablement retenue dans le cytosol. La partie amont de la région 5 'UTR de DUT-3 est identique à celle de DUT-M, cependant, la séquence leader mitochondriale - présente dans le premier exon de l'isoforme DUT-M - est absente de l'isoforme DUT-3. On prévoyait que la quatrième isoforme suggérée (DUT-4) ressemblerait étroitement à l'isoforme DUT-N, ne différant que par quelques acides aminés à l'extrémité N-terminale. Le premier exon de cette isoforme est situé en amont des autres isoformes dans le génome, par conséquent, son expression peut être pilotée par un promoteur alternatif pour une régulation altérée potentielle de cette isoforme. Aucune donnée n'a encore été rapportée sur les niveaux d'expression physiologique ou le(s) rôle(s) de ces deux nouvelles isoformes de dUTPase humaine.
Nous présentons ici les données d'expression génique des quatre isoformes de la dUTPase humaine dans diverses lignées cellulaires cancéreuses et humaines normales afin de mieux comprendre le rôle physiologique des nouvelles isoformes. La RT-qPCR était notre méthode de choix pour identifier les deux nouvelles isoformes et quantifier l'expression de l'ARNm des quatre isoformes séparément dans diverses lignées cellulaires. Les avantages de la RT-qPCR comprennent son excellente spécificité, sa large plage dynamique linéaire, sa sensibilité et sa reproductibilité exceptionnelles11,12,13,14,15. Pour développer une méthode RT-qPCR fiable pour l'analyse de l'expression génique, une optimisation approfondie et l'utilisation de gènes de référence appropriés sont nécessaires16,17,18. Dans un article précédent, nous avons identifié de nouveaux gènes de référence dans les mêmes lignées cellulaires humaines normales et cancéreuses que nous utilisons dans cette étude19. De plus, nous avons utilisé la même approche et effectué les mêmes étapes d'optimisation pour développer une méthode RT-qPCR pour l'analyse de l'expression génique des isoformes dUTPase.
Notre objectif était de déterminer spécifiquement le niveau d'expression de l'ARNm des isoformes de la dUTPase. Tout d'abord, nous avons étudié les bases de données Ensemble, UniProt et NCBI Reference Sequences (RefSeq) et avons également pris en compte le projet Consensus CDS (CCDS). Dans la base de données Ensemble, 8 isoformes codant pour les protéines et 3 isoformes ne codant pas pour les protéines sont présentes, dont 9 ont des identifiants UniProt (P33316 [DUT-M], P33316-2 [DUT-N], A0A0C4DGL3 [DUT-3], H0YNW5 [DUT-4], H0YNJ9, H0YKC5, H0YMP1, H0YMM5, H0YKI0). Nous avons effectué un alignement de séquences de protéines multiples avec l'outil en ligne Clustal Omega en utilisant les paramètres par défaut. La Fig. 1 supplémentaire montre les résultats de l'alignement. L'enzyme dUTPase possède cinq motifs conservés parmi les eucaryotes, les procaryotes, les virus à ADN et les rétrovirus2. Sur les 9 isoformes décrites dans la base de données UniProt, seules 4 contiennent tous les motifs conservés, y compris les isoformes bien connues DUT-N et DUT-M, et deux nouvelles isoformes, appelées DUT-3 et DUT-4 dans le présent article . De plus, seules ces 4 isoformes sont présentes dans la base de données NCBI RefSeq (NM_001025248.2 [DUT-M], NM_001948.4 [DUT-N], NM_001025249.1 [DUT-3] et NM_001330286.2 [DUT-4]) et avoir des identifiants CCDS (CCDS32231 [DUT-M], CCDS45255 [DUT-N], CCDS45256 [DUT-3] et CCDS81879 [DUT-4]). La base de données du CCDS contient des séquences annotées de manière cohérente et de haute qualité. De plus, nous avons étudié les isoformes de la dUTPase humaine dans la base de données PeptideAtlas20. Outre les isoformes canoniques DUT-N et DUT-M, les seules protéines avec une couverture peptidique à 100% sont les DUT-3 et DUT-4. Couverture peptidique des autres isoformes hypothétiques incomplète, remettant en question l'existence cellulaire de ces protéines. En résumé, notre objectif était d'étudier uniquement les quatre isoformes fonctionnelles : DUT-M, DUT-N, DUT-3 et DUT-4.
La figure 1A montre la région promotrice de la séquence génomique du gène DUT. Toutes les isoformes de dUTPase sont générées par l'utilisation de promoteurs alternatifs et l'épissage alternatif, cependant, toutes les isoformes partagent la même extrémité 3 'au niveau de l'ARNm et l'extrémité C-terminale correspondante au niveau de la protéine. Outre la détermination des niveaux d'expression génique des quatre isoformes de dUTPase, nous avons également cherché à déterminer l'expression de toutes les isoformes ensemble (DUT-all) en concevant des paires d'amorces situées dans la séquence commune. Une explication détaillée de la conception de l'amorce utilisée pour la détermination spécifique à l'isoforme peut être trouvée dans Matériels et méthodes. Le tableau 1 contient les paramètres clés des amorces utilisées dans cette étude. La figure 1B montre le.
Séquence génomique partielle (A) et les séquences protéiques des isoformes de la dUTPase (B). Panneau (A) : Le premier exon de l'isoforme DUT-4 est représenté en orange, le premier exon de l'isoforme DUT-3 est représenté en bleu clair. Le premier exon de l'isoforme DUT-M contient le premier exon de l'isoforme DUT-3 (bleu clair) et contient également le segment de séquence bleu foncé, unique à l'isoforme DUT-M. Le premier exon de l'isoforme DUT-N est représenté par des segments de séquence rouges et verts, où la séquence en rouge est unique à l'isoforme DUT-N tandis que la séquence en vert est commune à toutes les isoformes. Les séquences d'amorces utilisées dans la RT-qPCR sont soulignées. L'amorce avant couvrant l'intron conçue pour l'isoforme DUT-3 est représentée sur fond gris. L'amorce inverse commune est représentée sur fond jaune. Les sites d'initiation de la traduction (ATG) sont indiqués en texte italique en ombre colorée comme l'isoforme correspondante (DUT-M, bleu foncé ; DUT-N, rouge ; DUT-3, bleu clair ; DUT-4, orange). (B) Séquence protéique des isoformes de la dUTPase. Le segment peptidique correspondant au premier exon est coloré selon la séquence génomique, les autres séquences exoniques sont en noir. La séquence de couleur vert foncé est commune à toutes les isoformes à l'exception de DUT-3. La séquence de couleur vert clair est commune à toutes les isoformes. Le signal de localisation nucléaire du cœur (KRAR) est souligné. La figure a été créée avec Microsoft Office 2013.
Dans notre article précédent, nous avons identifié des gènes de référence appropriés pour la normalisation de l'expression relative des gènes mesurée avec RT-qPCR19. Dans notre étude actuelle, nous utilisons les mêmes échantillons d'ARN préparés précédemment. Nous avons préparé trois échantillons d'ARN biologiques répliqués à partir de 20 lignées cellulaires humaines cancéreuses et normales. Peu de temps après, des lignées cellulaires normales et cancéreuses ont été cultivées et récoltées à partir de trois réplicats biologiques. Après extraction, l'intégrité des échantillons d'ARN a été étudiée par électrophorèse sur gel d'agarose. Deux bandes distinctes étaient visibles sur l'image du gel d'agarose, qui correspondent aux sous-unités d'ARN ribosomal 18S et 28S, indiquant l'absence de dégradation et de contamination de l'ADN génomique, donc une bonne qualité globale des échantillons d'ARN préparés. Pour déterminer la concentration et la pureté des échantillons d'ARN, des mesures NanoDrop ont été effectuées. Les rapports 260/280 se situaient dans la plage de 2,02 à 2,11 démontrant l'absence de contamination protéique. Les rapports d'absorbance 260/280 et 260/230 et les rendements d'ARN ainsi que les résultats d'électrophorèse sur gel sont résumés dans notre article précédent en tant que matériel supplémentaire19.
La performance de la réaction de transcription inverse (RT) dépend fortement de l'enzyme transcriptase inverse, de la stratégie d'amorçage et de la quantité d'ARN dans la réaction21,22,23. Il est fondamental de travailler dans la plage dynamique linéaire de la réaction RT pour obtenir des résultats d'expression génique fiables avec qPCR. L'étude de chaque ARN cible est cruciale, y compris les cibles d'intérêt et les gènes de référence. Pour les gènes de référence utilisés dans cette étude, le même processus d'optimisation décrit ci-dessous a été effectué et les résultats ont été publiés dans notre article précédent19. Nous avons comparé deux kits de transcription inverse disponibles dans le commerce : le kit de synthèse d'ADNc Maxima First Strand pour RT-qPCR et le kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité. Après avoir préparé une série de dilutions quadruples en 6 points à partir d'un échantillon d'ARN, la réaction de transcription inverse a été effectuée en utilisant chaque kit. La quantité d'ARN total dans la réaction variait de 50 à 1600 ng. Les points les plus et les moins concentrés sont sortis de la plage dynamique linéaire, cependant, la linéarité a été confirmée dans la plage comprise entre 100 et 800 ng d'ARN pour toutes les cibles, y compris les gènes de référence (Fig. 2). Nous avons effectué une régression linéaire des moindres carrés à la moyenne des répliques techniques dans la plage de 100 à 800 ng d'ARN. Le kit de synthèse d'ADNc Maxima First Strand pour RT-qPCR a entraîné des valeurs Cq inférieures indiquant une meilleure efficacité de transcription inverse pour toutes les cibles, y compris les gènes de référence. Dans le cas de l'isoforme DUT-M, la pente de la ligne ajustée linéaire était nettement plus plate en utilisant le kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité, tout en utilisant le kit de synthèse d'ADNc Maxima First Strand pour RT-qPCR, la pente de la ligne ajustée linéaire était adéquat. Avec l'ancien kit, la sensibilité de la détermination de l'isoforme DUT-M serait clairement compromise. En conséquence, pour d'autres expériences, le kit de synthèse d'ADNc Maxima First Strand pour RT-qPCR a été sélectionné et 200 ng d'ARN total ont été utilisés.
Optimisation de la réaction de transcription inverse. Les valeurs Cq résultant des mesures qPCR des séries de dilution d'ARN sont présentées en comparant le kit de synthèse d'ADNc Maxima First Strand pour RT-qPCR (lignes noires) et le kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (lignes grises). À chaque point de concentration, trois répétitions techniques pour les deux kits sont représentées par des cercles creux. La régression linéaire des moindres carrés a été effectuée sur la moyenne des répliques techniques dans la plage de quantité d'ARN de 100 à 800 ng par réaction. Les graphiques individuels pour (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 et pour (E) DUT-tous ont été créés avec OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) et le la figure a été assemblée à l'aide de CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).
Pour la quantification précise de l'expression des gènes cibles, il est crucial de déterminer l'efficacité de la qPCR pour chaque cible. De plus, les méthodes de qPCR précises et robustes sont caractérisées avec une grande efficacité24. Des séries de dilutions à partir de produits PCR ont été préparées et utilisées comme matrice dans les réactions qPCR suivantes en utilisant trois répétitions techniques. En utilisant cette approche, une large plage de concentration peut être étudiée, mais l'utilisation de dilutions en série de la matrice d'ADNc pour déterminer l'efficacité prendrait en compte l'effet de matrice25. Par conséquent, l'efficacité a également été déterminée avec la matrice d'ADNc pour l'isoforme DUT-N (97,7 %) et la cible DUT-all (100 %). En comparant les deux approches, nous n'avons pas trouvé de différence considérable dans les valeurs d'efficacité - 97 % pour l'isoforme DUT-N et 96,1 % pour la cible DUT-all en utilisant les produits PCR comme matrice. Les valeurs Cq résultantes ont été tracées par rapport à la dilution appliquée et une régression linéaire des moindres carrés a été effectuée jusqu'à la moyenne des répliques techniques (Figure supplémentaire S2). Les valeurs d'efficacité ont été calculées à partir de la pente de la droite d'ajustement26. Les valeurs d'efficacité et les valeurs des coefficients de régression sont résumées dans le tableau 1.
Pour vérifier la spécificité des produits PCR concernant les quatre isoformes, nous avons envoyé des produits PCR pour le séquençage Sanger, mais comme la longueur de tous les produits PCR est inférieure à 90 paires de bases, une conception PCR imbriquée a été appliquée27. Un produit de PCR plus long a été généré pour chaque cible avec une autre amorce inverse et l'amorce directe appropriée et ces produits ont été purifiés et analysés avec un séquençage Sanger. La séquence des produits de PCR plus longs était identique à la séquence correspondante dans les bases de données publiques. Ces produits de PCR plus longs contiennent la séquence des produits de PCR à cycle unique respectifs. Ensuite, les produits séquencés ont été dilués et utilisés comme matrice dans un deuxième cycle de PCR - en utilisant les amorces répertoriées dans le tableau 1 - en plus d'une matrice d'ADNc humain. L'identité des deux produits de PCR de la réaction de PCR nichée et à tour unique a été évaluée en comparant les résultats de l'analyse de la courbe de fusion et de l'électrophorèse sur gel d'agarose. Étant donné que les courbes de fusion étaient identiques (Figure supplémentaire S3) et que les bandes apparaissaient dans la même position sur le gel d'agarose (Figure supplémentaire S4), nous avons conclu que chaque produit de PCR est spécifique à la cible visée.
Dans nos travaux précédents, nous avons étudié 12 gènes de référence candidats dans les mêmes lignées cellulaires humaines normales et cancéreuses que nous utilisons dans la présente étude19. Nous avons identifié SNW1 et CNOT4 comme de nouveaux gènes candidats de référence sur la base des données génétiques de la lignée cellulaire ARN HPA de The Human Protein Atlas28. Outre les gènes de référence largement utilisés (ACTB, GAPDH, IPO8, PPIA, PUM1, RPL30, TBP et UBC), nous avons également inclus HNRNPL et PCBP1 dans notre étude, comme suggéré par Jo et al.29. Plusieurs approches ont été appliquées pour évaluer les résultats, telles que GeNorm, NormFinder, BestKeeper et les méthodes Comparative ΔCt. Pour une normalisation fiable, l'utilisation d'au moins deux gènes de référence est recommandée pour minimiser les biais expérimentaux16,30,31. Sur la base de nos résultats, nous avons suggéré l'utilisation de IPO8, PUM1, HNRNPL, SNW1 et CNOT4 comme gènes de référence stables19, en conséquence, nous avons utilisé cet ensemble de gènes comme références pour l'analyse de l'expression génique des isoformes dUTPase. Pour évaluer l'effet de la privation de sérum, CNOT4, PUM1 et PCBP1 ont été utilisés comme gènes de référence. Séquences protéiques pour les isoformes dUTPase, qui sont colorées selon la séquence génomique.
Après avoir préparé trois échantillons d'ARN biologiques répliqués à partir de notre ensemble de lignées cellulaires humaines cancéreuses et normales, l'expression des isoformes de dUTPase, ainsi que la cible DUT-all ont été étudiées. À cette fin, la quantité totale d'ARN utilisée dans la réaction de transcription inverse et le volume d'ADNc amplifié dans la réaction qPCR ont été maintenus constants. Nous avons utilisé la méthode ΔΔCq pour le calcul des valeurs d'expression génique en appliquant IPO8, PUM1, HNRNPL, SNW1 et CNOT4 comme gènes de référence. Les courbes d'amplification pour les lignées cellulaires ayant l'expression normalisée relative la plus élevée et la plus faible des isoformes dUTPase et de la cible DUT-all sont illustrées dans la figure supplémentaire S5. Sur la base des valeurs Cq, l'isoforme DUT-N a l'expression la plus élevée des isoformes dUTPase dans toutes les lignées cellulaires étudiées, suivie de l'isoforme DUT-M et de l'isoforme DUT-3. L'isoforme DUT-4 a la plus faible expression des isoformes dUTPase, cependant les isoformes DUT-3 et DUT-4 sont exprimées dans une mesure similaire dans certaines des lignées cellulaires étudiées.
Les valeurs d'expression normalisées relatives pour chaque isoforme de dUTPase et la cible DUT-all pour les vingt lignées cellulaires étudiées sont illustrées sur la figure 3A. Les valeurs d'expression normalisées relatives ainsi que l'écart type sont résumées dans le tableau supplémentaire S1. L'expression normalisée relative des isoformes DUT-M et DUT-3 s'est avérée la plus élevée dans les lignées cellulaires U-937, RPMI-8226 et U-251MG et la plus faible dans la lignée cellulaire MDA-MB-231. Dans le cas des cibles DUT-N, DUT-4 et DUT-all, l'expression normalisée relative était considérablement élevée dans les cellules HL-60(TB), U-937, MOLT-4, RPMI-8226 et U-251MG. lignes. En comparant la lignée de cellules souches pluripotentes humaines HUES-9 et la lignée de cellules souches pluripotentes induites XCL-1, l'expression normalisée relative de chaque isoforme et de la cible DUT-all ne diffère pas significativement car les valeurs de p étaient supérieures ou égales à 0,4 dans tous les cas. Les niveaux d'expression de l'isoforme DUT-4 ont montré les plus grandes différences entre les lignées cellulaires, avec une différence de 50 fois entre le niveau d'expression le plus élevé (U-937) et le plus bas (HCT-116).
Données d'expression génique normalisées relatives pour les cibles dUTPase et analyse de corrélation des valeurs Cq. (A) Dans chaque panneau, la valeur d'expression de la lignée cellulaire avec l'expression la plus faible a été fixée à 1. L'échelle de l'axe y est logarithmique avec la base 10 et est représentée uniformément de 1 à 100 dans chaque panneau. La barre d'erreur montre l'écart type de trois répétitions biologiques (n = 3) pour chaque lignée cellulaire. Les couleurs individuelles correspondent aux couleurs utilisées dans le tableau 2. Les graphiques individuels ont été créés avec CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad). (B) Analyse de corrélation des valeurs Cq du DUT-N avec la cible DUT-all et (C) du DUT-M avec la cible DUT-3. La plage affichée sur les axes est constante dans les deux graphiques à des fins de comparabilité. Les valeurs des coefficients de régression ont été déterminées avec une régression linéaire des moindres carrés à tous les points de données. Des graphiques individuels ont été créés avec OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) et la figure a été assemblée à l'aide de CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).
Pour révéler des éléments régulateurs communs potentiels parmi les niveaux d'expression relatifs des différentes isoformes, nous avons analysé la corrélation des valeurs Cq de chaque combinaison de deux cibles des isoformes dUTPase et de la cible DUT-all (Figure supplémentaire S6). Nous avons trouvé une corrélation entre les valeurs Cq de l'isoforme DUT-N et la cible DUT-all (Fig. 3B), de plus, entre les isoformes DUT-M et DUT-3 (Fig. 3C). Les deux corrélations ont été caractérisées avec des valeurs de coefficient de régression supérieures à 0,85 déterminées avec une régression linéaire des moindres carrés à tous les points de données. En revanche, toutes les autres combinaisons ont été caractérisées avec des valeurs de coefficient de régression inférieures à 0,62, indiquant un manque de corrélation. L'analyse de corrélation a fourni trois observations importantes. Premièrement, étant donné que DUT-N a l'expression la plus élevée des isoformes de dUTPase sur la base des courbes d'amplification, cette isoforme domine l'expression globale de dUTPase, car elle se reflète dans la forte corrélation entre le DUT-N et les modèles d'expression DUT-all. Deuxièmement, étant donné que les isoformes DUT-M et DUT-3 sont transcrites à partir du même promoteur, la corrélation entre ces deux cibles était attendue et cette découverte renforce encore la suggestion d'un promoteur commun pour DUT-M et DUT-3. Troisièmement, l'absence de corrélation pour toutes les combinaisons impliquant l'isoforme DUT-4 plaide pour la présence d'un promoteur alternatif qui fournit une régulation indépendante et différente de l'expression pour DUT-4.
Comme le rapport des différentes isoformes exprimées peut être important pour le bon fonctionnement d'une cellule, nous avons étudié le schéma des isoformes de dUTPase exprimées par rapport à l'expression globale dans les lignées cellulaires normales et cancéreuses. Nous avons défini l'expression normalisée relative d'un échantillon biologique répliqué de la lignée cellulaire MDA-MB-231 à 1. Nous avons divisé les valeurs d'expression normalisées relatives de chaque isoforme avec les valeurs d'expression normalisées relatives DUT-all et le logarithme de base 2 du rapport a été calculé pour fournir une distribution normale. Pour décrire la relation du niveau d'expression des différentes isoformes, nous avons utilisé ces valeurs dites "indicateurs de ratio" pour souligner que les valeurs numériques ne sont pas à considérer, seules les différences observées sont intéressantes. Comme la variance des trois échantillons biologiques répétés mesurés dans différentes lignées cellulaires n'est pas égale, nous avons effectué l'analyse non paramétrique de Kruskal – Wallis suivie de comparaisons par paires Conover-Iman avec correction de Bonferroni à l'aide de XLSTAT. Pour chaque isoforme, les indicateurs de rapport des lignées cellulaires normales ont été comparés au groupe de lignées cellulaires cancéreuses. La figure 4. illustre les résultats.
Relation entre le niveau d'expression normalisé relatif des différentes isoformes (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 et l'expression globale de dUTPase mesurée avec la cible DUT-all . Toutes les lignées cellulaires cancéreuses ont été incluses dans un groupe qui a été utilisé pour des comparaisons par paires avec chaque lignée cellulaire normale. Les lignées cellulaires cancéreuses sont colorées en rouge. Les couleurs individuelles pour les lignées cellulaires normales correspondent aux couleurs utilisées dans le tableau 2. L'axe y montre des indicateurs de rapport qui sont le rapport de la valeur d'expression normalisée relative de chaque isoforme à la valeur d'expression globale sur une échelle logarithmique. La moyenne de chaque groupe est indiquée par des lignes noires. Les valeurs p indiquent les résultats des comparaisons par paires. Les différences se sont avérées significatives à p < 0,0018 et sont indiquées par des astérisques (*). Des graphiques individuels ont été créés avec OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) et la figure a été assemblée à l'aide de CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).
Dans le cas des isoformes DUT-N et DUT-4, aucune différence significative n'a été trouvée. Comme le DUT-N a l'expression la plus élevée, on s'attendait à ce que la relation de cette isoforme à l'expression globale soit presque égale parmi les lignées cellulaires. L'isoforme DUT-4 a l'expression la plus faible, mais son indicateur de rapport ne montre pas non plus de changements significatifs, il est assez stable parmi les lignées cellulaires normales. Cependant, dans le cas des isoformes DUT-M et DUT-3, des différences ont été observées parmi les lignées cellulaires normales. Les lignées cellulaires HEK293, HUES-9 et XCL-1 ne se sont pas avérées significativement différentes du groupe des lignées cellulaires cancéreuses. La lignée de cellules souches pluripotentes humaines HUES-9 et la lignée de cellules souches pluripotentes induites XCL-1 ont montré des valeurs d'indicateur de rapport similaires, non élevées, plaidant pour la ressemblance de ces lignées cellulaires. Le HEK293 est une lignée cellulaire précurseur partiellement différenciée transformée avec Ad5, et cela peut être la raison de sa divergence par rapport au groupe cellulaire normal. En revanche, les lignées cellulaires normales différenciées HMEC, HUVEC/TERT2, MRC-5 et HFF-1 ont montré des valeurs significativement augmentées. Les valeurs des indicateurs de rapport pour les isoformes DUT-M et DUT-3 ont démontré des changements parallèles plaidant davantage pour leur promoteur commun.
La privation de sérum est un traitement couramment appliqué utilisé dans plusieurs domaines de recherche étudiant les lignées cellulaires humaines pour révéler les mécanismes moléculaires impliqués dans différents processus cellulaires, voies métaboliques et effets des traitements médicamenteux32. Auparavant, l'expression relative de l'ARNm de DUT-N et DUT-M lors d'une privation de sérum a été étudiée dans des fibroblastes pulmonaires humains normaux 34Lu par Ladner et al. en utilisant la technique du Northern blot7. Les résultats de cette étude ont montré que l'expression de l'ARNm de DUT-M était constitutive, cependant, l'expression de l'ARNm de DUT-N a diminué de manière significative lors de la privation de sérum. Il était intéressant d'étudier l'expression des deux nouvelles isoformes de dUTPase, ainsi que la cible DUT-N et DUT-M et également la cible DUT-all sous traitement de famine sérique dans diverses lignées cellulaires pour décider si les effets sont cellulaires. dépendant de la ligne. Compte tenu de notre ensemble de 13 lignées cellulaires cancéreuses humaines, l'arrêt du cycle cellulaire ne peut pas être réalisé efficacement pour la plupart des lignées cellulaires, soit parce que la croissance des cellules n'est pas affectée, soit parce que la viabilité cellulaire est fortement compromise en cas de famine sérique. Par conséquent, nous avons sélectionné trois lignées de cellules cancéreuses humaines - HeLa, A-549 et MDA-MB-231 - pour lesquelles ce traitement est applicable33. La privation de sérum a été appliquée à trois cultures biologiques répliquées pendant 2 jours dans le cas de la lignée cellulaire MDA-MB-231 et pendant 4 jours dans le cas des lignées cellulaires HeLa et A-549. La distribution des phases du cycle cellulaire des cultures cellulaires traitées et non traitées a été analysée par cytométrie en flux. Une élévation du rapport des cellules en phase G1 a été observée parallèlement à une diminution du rapport des cellules en phase G2 et S lors de la privation de sérum (Figure supplémentaire S7). Le rapport des cellules en phase G1 dans les cellules affamées de sérum était supérieur à 70 % dans tous les cas, par conséquent, l'arrêt du cycle cellulaire a été réalisé avec succès.
L'expression génique des isoformes de dUTPase ainsi que la cible DUT-all ont été déterminées par analyse RT-qPCR comparant les cellules affamées de sérum avec les cellules non traitées (Fig. 5). Pour la normalisation, trois gènes de référence - CNOT4, PUM1 et PCBP1 - ont été sélectionnés sur la base de notre article précédent portant sur les gènes de référence19. L'expression relative normalisée de l'isoforme DUT-4 est restée constante pendant la privation de sérum dans les trois lignées cellulaires étudiées. Dans le cas des isoformes DUT-M et DUT-3 - qui sont transcrites à partir du même promoteur - l'expression normalisée relative a augmenté de manière significative dans tous les cas. L'isoforme DUT-N a l'expression la plus élevée des isoformes dUTPase sur la base des courbes d'amplification observées. Lors de la privation de sérum, l'expression relative normalisée de l'isoforme DUT-N est restée constante dans les cellules HeLa, cependant, a diminué de manière significative dans les cellules A-549 et MDA-MB-231. L'expression normalisée relative de la cible DUT-all a changé dans la même direction que l'isoforme DUT-N, cependant, l'ampleur du changement s'est avérée moindre. Ce phénomène peut être dû au fait que l'expression des isoformes DUT-M et DUT-3 est augmentée lors de la privation de sérum et cela peut compenser la diminution de l'expression de l'isoforme DUT-N. Les valeurs d'expression relatives ainsi que les barres d'erreur pour les échantillons affamés de sérum et non traités et les valeurs p sont résumées dans le tableau supplémentaire S2.
Expression normalisée relative des isoformes dUTPase (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 et (E) la cible DUT-all dans HeLa (rouge), A -549 (orange) et MDA-MB-231 (jaune) lignées cellulaires après privation de sérum et (F) analyse Western blot des protéines dUTPase dans la lignée cellulaire U-937. (AE) NT, non traité (colonnes simples) ; SS, sérum affamé (colonnes striées). Les couleurs individuelles correspondent aux couleurs utilisées dans le tableau 2. L'échelle de l'axe y est logarithmique de base 10 et est représentée uniformément de 1 à 10 dans chaque panneau. Dans chaque panneau, le groupe biologique avec l'expression la plus faible a été fixé à 1. Les barres d'erreur montrent l'écart type de trois répétitions biologiques (n = 3) pour chaque lignée cellulaire. Le nombre d'astérisques indique une possibilité croissante que l'expression génique change lors d'une privation de sérum. * p < 0,1, ** p < 0,01, *** p < 0,001 tel que calculé par le logiciel CFX Maestro. (F) Trois échantillons techniques répliqués pour la détection des protéines dUTPase à l'aide de western blot. Sur le côté gauche, les protéines dUTPase cibles et la protéine actine comme référence sont représentées par des flèches. Sur le côté droit, les valeurs de masse moléculaire théoriques correspondantes sont indiquées. Les images individuelles en taille réelle sont disponibles en tant que Figure supplémentaire S8. Les graphiques individuels pour (A) DUT-M, (B) DUT-N, (C) DUT-3, (D) DUT-4 et pour (E) DUT-all ont été créés avec CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad). (F) L'image a été créée avec le logiciel Image Lab 4.1 (Bio-Rad). La figure a été assemblée à l'aide de CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).
Une découverte majeure de l'analyse des effets de la privation de sérum sur les niveaux d'expression des isoformes de dUTPase est que les perturbations induites par la privation se produisent de manière spécifique à la lignée cellulaire. Fait important, comme le montre la figure supplémentaire S7, dans toutes les lignées cellulaires, nous avons observé l'arrêt du cycle cellulaire induit par la famine dans des proportions similaires. Par conséquent, les différentes perturbations observées dans les niveaux d'expression des isoformes de dUTPase ne sont pas dues à des différences dans l'arrêt du cycle cellulaire. Le résultat le plus frappant est que la lignée cellulaire HeLa montre une forte résilience contre la privation de sérum et maintient l'isoforme DUT-N à un niveau d'expression élevé, contrairement aux autres lignées cellulaires (Fig. 5). Le concept principal décrit dans la littérature est que la dUTPase a un double rôle : elle est essentielle à la fois pour éliminer le dUTP pour la désinfection du pool de dNTP et pour produire du dUMP pour la synthèse de novo du thymidylate. En accord avec cela, l'isoforme DUT-N la plus abondante est exprimée principalement pendant la phase S du cycle cellulaire et de manière dépendante de la croissance, de la même manière que d'autres membres de la biosynthèse des précurseurs de nucléotides et de la voie de réplication de l'ADN7,35,36, 37. Pendant l'arrêt du cycle cellulaire, la prolifération s'arrête, ainsi les cellules n'ont pas besoin de dNTP pour se répliquer. Cependant, la synthèse de réparation peut encore se produire. La diminution observée de l'expression de l'isoforme DUT-N à la privation de sérum est en accord avec le rôle de l'enzyme. Cependant, nos données actuelles indiquent également que bien que ce schéma puisse être typique, dans certaines lignées cellulaires cancéreuses, la régulation étroite de l'expression de la dUTPase peut être perdue car les cellules cancéreuses perdent leur sensibilité aux molécules de signalisation au cours de la prolifération continue. Dans le cas de la lignée cellulaire HeLa, la prolifération s'arrête, cependant, le haut niveau d'expression de l'isoforme DUT-N est préservé.
Il a été précédemment démontré que l'isoforme DUT-M était exprimée de manière constitutive à la fois au niveau de l'ARNm et des protéines dans les cellules 34Lu7. En revanche, nous avons constaté que dans les trois lignées cellulaires étudiées, l'expression de l'isoforme DUT-M augmentait de manière significative lors de la privation de sérum. Cet effet peut être important pour la biosynthèse du thymidylate mitochondrial et pour une meilleure préservation de l'intégrité de l'ADN mitochondrial lors d'une privation de sérum. Nous en concluons que l'expression des isoformes DUT-N et DUT-M est régulée par des mécanismes entièrement différents et dépend également des lignées cellulaires. Nous avons également constaté que le niveau d'expression de l'isoforme DUT-3 démontre des changements parallèles aux niveaux d'expression DUT-M dans toutes les lignées cellulaires étudiées, plaidant davantage pour leur promoteur commun. L'absence de changements significatifs dans le niveau d'expression de l'isoforme DUT-4 (contenant le même NLS que DUT-N) indique que les trois lignées cellulaires que nous avons étudiées à cet égard préservent vraisemblablement la localisation nucléaire de la dUTPase même en cas de famine.
Outre la détermination de l'expression de l'ARNm des isoformes de dUTPase, nous avons également étudié l'expression protéique des isoformes à l'aide d'une analyse Western blot (Fig. 5F) en utilisant un gel d'acrylamide à 16%. L'image originale avec un temps d'exposition de 1 s, l'image avec un temps d'exposition de 40 s et l'image fusionnée avec l'échelle protéique sont disponibles en tant que Figure supplémentaire S8. Nous avons utilisé la lignée cellulaire U-937, qui a la plus forte expression des isoformes DUT-N et DUT-4 tout en ayant une expression élevée des isoformes DUT-M et DUT-3 par rapport aux autres lignées cellulaires étudiées dans cette étude. Nous avons utilisé l'actine comme référence. Nous avons mis en évidence trois bandes distinctes correspondant aux isoformes DUT-M, DUT-N et DUT-3, par ordre de masse moléculaire décroissante. Nous avons calculé le poids moléculaire théorique des isoformes dUTPase à l'aide de l'outil Protein Molecular Mass (https://www.bioinformatics.org/sms/prot_mw.html), de plus, nous avons également calculé les valeurs empiriques pour les trois isoformes détectées sur la base de la bandes de l'échelle protéique. L'isoforme DUT-N a l'expression d'ARNm la plus élevée et l'expression de protéine la plus élevée comme on le voit sous la forme d'une immense bande sur le blot. La masse moléculaire théorique de l'isoforme DUT-4 (17,83 kDa) est presque égale à la masse moléculaire théorique de l'isoforme DUT-N (17,75 kDa), par conséquent, l'isoforme DUT-4 ne peut pas être détectée à l'aide de la technique Western blot. Les masses moléculaires théorique et empirique de l'isoforme DUT-M (19,35 kDa et 19,38 kDa, respectivement) et de l'isoforme DUT-N (17,75 kDa et 17,68 kDa, respectivement) sont raisonnablement proches. La masse moléculaire empirique (15,41 kDa) de la troisième bande détectée est essentiellement la même que la masse moléculaire théorique (15,4 kDa) de l'isoforme DUT-3 confirmant l'identité de cette nouvelle isoforme.
La dUTPase est une enzyme omniprésente présente dans tous les organismes eucaryotes étudiés jusqu'à présent, des plantes aux animaux en passant par les levures34. L'essentialité de cette enzyme a été démontrée par l'utilisation de modèles knock-out tandis que les modèles knock-down démontrent une auxotrophie ou une sensibilité aux agents endommageant l'ADN4,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45,46,47. Contrairement à sa nature indispensable, la distribution des isoformes de la dUTPase n'a été étudiée que dans quelques organismes modèles. Chez la souris, une isoforme nucléaire et une isoforme mitochondriale de la dUTPase ont été décrites, comme chez l'homme6,7,27. Chez Drosophila melanogaster, il a été démontré qu'il existe une isoforme de dUTPase nucléaire et une isoforme cytoplasmique48,49. Chez Saccharomyces cerevisiae, une seule diphosphatase bifonctionnelle dITP/dUTP a été mise en évidence, cependant, sa localisation n'a pas été étudiée50. Chez Dictyostelium discoideum, une seule isoforme de dUTPase a été identifiée qui se localise uniquement dans les mitochondries51. Dans ce travail, nous avons identifié deux isoformes supplémentaires pour l'enzyme dUTPase au niveau de l'ARNm dans une grande variété de lignées cellulaires humaines d'origines différentes (Fig. 6). Il est important de noter que nous avons identifié l'une de ces nouvelles isoformes au niveau protéique, dépourvue de tout signal de localisation organellaire (DUT-3). Nos données suggèrent maintenant que la présence de dUTPase dans le cytoplasme pourrait être un phénomène plus général et pas seulement un cas exceptionnel chez la mouche des fruits. En fait, étant donné que les dNTP peuvent diffuser librement à travers le pore nucléaire, il n'y a pas de besoin explicite et direct pour que l'enzyme dUTPase soit nucléaire. Cependant, la présence nucléaire de cette enzyme désinfectante peut fournir un contrôle plus efficace de l'élimination du dUTP pendant la synthèse de l'ADN et la dUTPase peut également interagir avec d'autres protéines nucléaires52.
Figure schématique illustrant les principaux aspects de cette étude. La couleur bleu foncé indique l'isoforme DUT-M, la couleur rouge indique l'isoforme DUT-N et les nouvelles isoformes DUT-3 et DUT-4 sont colorées respectivement en bleu clair et orange. Dans le coin supérieur droit, des courbes d'amplification représentatives sont affichées. La taille de police du nom des isoformes correspond à leurs niveaux d'expression relatifs. La localisation cellulaire hypothétique des isoformes de la dUTPase est représentée par des lignes pointillées. La figure a été créée à l'aide de CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation).
À la lumière de nos travaux actuels, le répertoire dUTPase dans les cellules humaines est plus étendu qu'on ne le pensait auparavant et il comprend quatre isoformes sous la régulation de trois promoteurs différents selon nos résultats. Il reste à déterminer si une autre variété d'isoformes de dUTPase peut également être identifiée chez d'autres espèces. Un promoteur réagit avec sensibilité au stress de famine, réduisant ainsi les niveaux d'ARNm nucléaire et total de la dUTPase jusqu'à cinq fois. Cependant, dans la lignée cellulaire HeLa, cette forte régulation est perdue, permettant potentiellement un meilleur contrôle contre l'uracilation de l'ADN même à l'état de repos (par exemple dans la synthèse de réparation). Parmi les trois promoteurs, celui pilotant la synthèse de l'isoforme de la dUTPase nucléaire DUT-4 présente le caractère le plus constitutif, renforçant l'importance de la présence nucléaire de la dUTPase.
Notre objectif était d'utiliser des lignées cellulaires populaires largement utilisées dans de nombreuses études de la littérature. Auparavant, nous avons résumé les aspects utilisés pour la sélection de 13 lignées cellulaires humaines cancéreuses et 7 normales19, exactement les mêmes lignées cellulaires ont également été utilisées dans cette étude. Les lignées cellulaires cancéreuses comprennent HeLa, MCF-7, A-549, K-562, HL-60(TB), HT-29, MDA-MB-231, HCT 116, U-937, SH-SY5Y, U-251MG , MOLT-4 et RPMI-8226, tandis que les lignées cellulaires normales comprennent HEK293, MRC-5, HUVEC/TERT2, HMEC, HFF-1, HUES-9 et XCL-1.
Les lignées cellulaires HEK293 (CRL-1573), HeLa (CCL-2), SH-SY5Y (CRL2266), U-937 (CRL-1593.2) et la lignée cellulaire de fibroblastes de prépuce humain HFF-1 (SCRC-1041) ont été achetées auprès de l'ATCC . Les lignées cellulaires A-549, HCT 116, HL-60(TB), HT-29, K-562, MCF-7, MDA-MB-231, MOLT-4, MRC-5 et RPMI-8226 ont été obtenues à partir du Programme de thérapie développementale du National Cancer Institute (National Institutes of Health). Les cellules HMEC immortalisées avec TERT ont été achetées auprès du département des services cellulaires de l'Institut Francis Crick. HUVEC/TERT2 et MRC-5 étaient un généreux don de József Tóvári. La lignée de cellules souches pluripotentes humaines HUES-9 a été aimablement fournie par Douglas Melton (HHMI). La lignée de cellules souches pluripotentes induites XCL-1 reprogrammée à partir de cellules de sang de cordon CD34+ par des vecteurs épisomiques, a été obtenue auprès de XCellScience (Novato, CAXIP-001-1 V). A-549, HCT 116, HEK293, HeLa, HL-60(TB), HT-29, K-562, MCF-7, MDA-MB-231, MOLT-4, RPMI-8226, SH-SY5Y, U- Les cellules 251MG et U-937 ont été cultivées dans le milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco, 72400-021) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS) (Gibco, 10500064) et de 1 % de pénicilline streptomycine (Gibco , 15140-122). Les cellules HFF-1 ont été maintenues sur des plaques recouvertes de gélatine (Sigma) dans un milieu DMEM-glutamax complété avec 10 % de FBS (Thermo Scientific). Les cellules HMEC ont été cultivées dans MEGM Mammary Epithelial Cell Growth Medium BulletKit (Lonza, CC-3150). Les cellules HUVEC/TERT2 ont été cultivées dans EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 (Lonza, 00190860) additionné de composants du kit EGM-2 Endothelial SingleQuots (Lonza, CC-4176). Les cellules MRC-5 ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Gibco, 11995-065) additionné de 20 % de FBS et de 1 % de pénicilline streptomycine. Les cellules HUES-9 et XCL-1 ont été maintenues sur des plaques à six puits revêtues de Matrigel (Corning) dans du milieu mTeSR (Stemcell Technologies). Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées à 37°C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère à 5% de CO2. Toutes les cultures cellulaires étaient exemptes de mycoplasmes comme déterminé par PCR. Les lignées cellulaires d'adhésion ont été passées lorsque la culture a atteint 40 à 50% de confluence pour éviter l'inhibition de contact. Les lignées cellulaires en suspension ont été passées tous les 2 à 3 jours. Pour l'extraction de l'ARN, les cellules ont été collectées après 2 jours de passage.
Pour le traitement de la privation de sérum, les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, 72400-021) additionné de 1 % de pénicilline streptomycine (Gibco, 15140-122) et sans 10 % de FBS inactivé par la chaleur. Les cellules après privation de sérum ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (Sigma, P3813), trypsinisées et remises en suspension dans du milieu frais additionné d'EDTA 3 mM (Sigma, E9884) - et en cas de cultures affamées de sérum - 10 mg/ml bovin albumine sérique (BSA, Sigma, A7906). L'EDTA et la BSA ont été dissous dans de l'eau MilliQ et les solutions mères ont été filtrées stérilement avec l'unité de filtration à membrane Millex-GP Millipore Express PES (Millipore). Les cellules ont été centrifugées à 200 g pendant 5 minutes à l'aide d'une centrifugeuse Eppendorf MiniSpin (type 5452) et lavées avec du PBS.
Les cellules adhésives ont été trypsinisées avec une solution de trypsine – EDTA (Sigma, T3924) et remises en suspension dans du milieu frais. Les cultures de cellules en suspension et les cellules adhésives trypsinisées ont été centrifugées à 200 g pendant 5 min à l'aide d'une centrifugeuse Eppendorf MiniSpin (type 5452) et lavées deux fois avec du PBS. Le culot a été remis en suspension dans du tampon RLT (une partie du kit Qiagen RNeasy Plus Mini) additionné de 1 % de bêta-mercaptoéthanol (Merck) et lysé par vortex pendant 1 min en utilisant des billes de verre stériles. Les échantillons lysés ont été conservés à - 20 ° C jusqu'à un traitement ultérieur. L'ARN a été extrait avec le kit Qiagen RNeasy Plus Mini en suivant les recommandations du fabricant. La digestion de la DNase sur colonne a été réalisée avec le kit de DNase sans RNase (Qiagen, 79254). L'ARN a été élue dans 50 ul d'eau sans nucléase (Ambion). La concentration et la pureté indiquées par les ratios 260/280 et 260/230 ont été déterminées avec NanoDrop ND-2000. Pour s'assurer qu'une quantité égale d'ARN est mesurée dans la réaction de transcription inverse suivante, la concentration de tous les échantillons d'ARN a été fixée à 24 ng/µl et vérifiée avec NanoDrop. Une électrophorèse sur gel d'agarose a été réalisée afin d'évaluer l'intégrité des échantillons d'ARN et la contamination potentielle de l'ADN génomique en utilisant de l'agarose à 1% (Sigma, A9539) et du tampon de fonctionnement TBE. De même, 600 ng d'ARN ont été mélangés avec un colorant de chargement de gel (New England Biolabs, B7024S) et chargés dans les puits du gel. GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific, SM1331) a été utilisé comme marqueur. Gel Doc XR + Imager (Bio-Rad) a été utilisé pour l'imagerie. Les échantillons d'ARN ont été conservés à - 80 ° C jusqu'à un traitement ultérieur.
Pour évaluer l'adéquation de la réaction de RT, le kit de synthèse d'ADNc Maxima First Strand pour RT-qPCR (Thermo Scientific, K1642) et le kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems, 4 368 814) ont été comparés. Les kits ont été utilisés conformément aux recommandations du fabricant et pour le kit de synthèse d'ADNc Maxima First Strand pour RT-qPCR, la réaction de RT a été réalisée à 65 ° C pendant 30 min. Une série de dilutions doubles en 6 points a été préparée à partir de l'ARN extrait des cellules HCT 116 et introduites dans la réaction RT avec la concentration de départ de 1600 ng/ul. Pour d'autres expériences, le kit de synthèse d'ADNc Maxima First Strand pour RT-qPCR a été utilisé avec 200 ng d'ARN introduits dans la réaction. La réaction de RT a été réalisée dans le système Applied Biosystems GeneAmp PCR 2700. Les échantillons d'ADNc ont été conservés à - 20 ° C jusqu'à un traitement ultérieur.
Le site d'initiation de la transcription de l'isoforme DUT-4 se situe en amont de celui des autres isoformes (Fig. 1A). Pour la détection de l'isoforme DUT-4, une amorce directe flanquant l'intron a été conçue dans son premier exon représenté en orange. L'isoforme DUT-M partage probablement le même promoteur avec l'isoforme DUT-3 car la transcription de ces isoformes commence à la même position colorée en bleu clair. La transcription de l'isoforme DUT-M se poursuit avec la séquence colorée en bleu foncé, alors que cette séquence qui correspond à la séquence d'adressage mitochondrial est absente dans l'isoforme DUT-3. L'amorce avant flanquant l'intron pour l'isoforme DUT-M a été conçue dans cet exon. La transcription des isoformes DUT-M et DUT-3 se poursuit avec la séquence colorée en vert. L'amorce avant couvrant l'intron pour l'isoforme DUT-3 est colorée en gris. La transcription de l'isoforme DUT-N commence par la séquence colorée en rouge et se poursuit par la séquence commune. Pour la détection de l'isoforme DUT-N, une conception d'amorce exonique a été appliquée. La figure 1B montre la séquence protéique des isoformes de dUTPase. Toutes les isoformes contiennent le signal de localisation nucléaire central (KRAR)10 à l'exception de l'isoforme DUT-3, dont le site d'initiation de la traduction se trouve en aval de la séquence commune verte en gras.
Nous avons également cherché à déterminer le niveau d'expression global de l'ARNm de la dUTPase (DUT-all). Comme la région codante commune de toutes les isoformes de dUTPase est très similaire à la variante de transcription 3 (NCBI RefSeq ID : NM_001291368.4) et 4 (NCBI RefSeq ID : NM_001291369.4) de la protéine à doigt de zinc Homo sapiens 534 (ZNF534), les paires d'amorces pour la séquence commune ont été conçus pour être situés dans la région 3' UTR. Pour l'amplification spécifique de l'isoforme DUT-3, les amorces sens ont été conçues pour être situées sur la jonction exon-exon (intron spanning design). Dans le cas des isoformes DUT-4 et DUT-M, les amorces sens et antisens ont été séparées par un intron (conception flanquant l'intron). La conception des amorces des isoformes susmentionnées excluait la possibilité d'amplifier la contamination par l'ADN génomique. L'isoforme DUT-N de la dUTPase a été déterminée à l'aide d'une conception d'amorce exonique. Pour toutes les cibles, trois ou quatre paires d'amorces ont été conçues et comparées avec une PCR à gradient de température couplée à une analyse de la courbe de fusion et à une électrophorèse sur gel d'agarose pour garantir la spécificité des produits de PCR. Une électrophorèse sur gel d'agarose a été réalisée pendant l'optimisation, tandis qu'une analyse de la courbe de fusion a été effectuée en routine après chaque réaction PCR. Les produits spécifiques ont été indiqués par une seule bande nette sur gel d'agarose et caractérisés par un seul pic avec analyse de la courbe de fusion. Dans le cas où plus d'une paire d'amorces générait des produits spécifiques, celle avec la valeur Cq la plus faible a été sélectionnée pour d'autres expériences.
Pour concevoir des paires d'amorces, l'outil de conception d'amorces NCBI a été utilisé53. La longueur du produit de PCR était limitée à 120 paires de bases (pb)54. Les températures de fusion des amorces ont été fixées entre 60 et 63 °C. La spécificité a été étudiée avec BLAST avec les paramètres suivants : au moins 5 mésappariements totaux avec des cibles non intentionnelles, dont au moins 3 mésappariements dans les 5 dernières bps à l'extrémité 3'. Les cibles avec plus de 6 mésappariements ont été ignorées pour le contrôle de spécificité. Les amorces ont été commandées auprès de Merck avec une purification par dessalage dans un format sec et dissoutes dans de l'eau sans nucléase en suivant la recommandation de faire des solutions de 100 µM. La concentration des solutions d'amorces a été vérifiée avec NanoDrop.
La réaction qPCR a été réalisée dans un volume final de 10 µL en utilisant MyTaq HS Mix (Bioline, BIO-25046), le colorant Evagreen (Biotium, 31000), de l'eau sans nucléase, une matrice d'ADNc et des amorces appropriées. Dans chaque réaction qPCR, 0,1 µl d'échantillon d'ADNc a été utilisé et les concentrations finales de toutes les amorces étaient de 500 nM. Trois répétitions techniques ont été utilisées pour chaque échantillon et chaque gène cible. Deux répliques techniques de la réaction de contrôle sans matrice (NTC) ont été mesurées pour chaque cible sur chaque plaque. Aucun contrôle de transcription inverse (TRN) n'a été mesuré au hasard pour 25 % des échantillons. Les contrôles NRT ont été préparés à partir des échantillons d'ARN en utilisant de l'eau sans nucléase au lieu de l'enzyme RT et du tampon de réaction. La différence entre les valeurs de Cq du NRT/NTC et des échantillons était supérieure à 10 dans la plupart des cas, et supérieure à 5 dans tous les cas.
Des plaques PCR transparentes à coque dure à 96 puits (Bio-Rad) et un film d'étanchéité pour plaque PCR Microseal 'B' (Bio-Rad) ont été utilisés. Le cycle thermique et la détection ont été effectués dans le système de détection PCR en temps réel CFX96 (Bio-Rad). Le protocole de cycle thermique comprend la dénaturation initiale et l'activation de la polymérase à chaud à 95 ° C pendant 5 min, suivies de 50 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 30 s et d'annelage/extension à 63 ° C pendant 30 s. Après amplification, l'analyse de la courbe de fusion a été effectuée de 60 °C à 95 °C avec un incrément de 0,5 °C toutes les 5 s. Pour comparer les courbes de fusion des produits de PCR utilisés dans l'identification des isoformes de dUTPase, l'incrément de température a été fixé à 0,2 °C.
Pour la détermination des valeurs d'efficacité de PCR à l'aide de produits de PCR, des échantillons d'ARN extraits de trois répliques biologiques de cellules HCT 116 ont été regroupés et introduits dans des réactions de transcription inverse pour chaque cible, suivies d'une amplification avec qPCR comme décrit ci-dessus. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant de l'agarose à 2 % et un tampon courant TAE. Les produits de PCR ont été purifiés à partir du gel à l'aide du gel NucleoSpin et du nettoyage PCR (Macherey – Nagel, 740609) conformément aux recommandations du fabricant. Les concentrations des solutions ont été déterminées avec NanoDrop. Des séries de dilutions en 7 points ont été préparées et chaque point de concentration a été introduit dans les réactions de qPCR dans la plage de concentration finale de 100 fg/µl à 0,0001 fg/µl avec trois répétitions techniques. Les valeurs de Cq ont été tracées par rapport au logarithme en base 10 de la concentration et la pente des courbes et des coefficients de régression ont été déterminées et les valeurs d'efficacité de la PCR ont été calculées avec la formule E(%) = [10^(1/-pente)- 1]*100 %. Les valeurs d'efficacité PCR obtenues à partir des mesures avec les produits PCR ont été utilisées pour d'autres calculs.
Nous avons également déterminé les valeurs d'efficacité de la PCR à l'aide d'échantillons d'ADNc pour deux cibles dUTPase, le DUT-N et DUT-all et, dans notre article précédent, pour les cibles de gènes de référence IPO8, PUM1, SNW1. A cette fin, l'ADNc dérivé de réplicats biologiques de cellules HCT 116 a été regroupé et une série de dilutions quadruples à 6 points a été préparée. Les points les plus concentrés contenaient 0,3 pl d'ADNc dans chaque puits. Trois répétitions techniques ont été appliquées pour chaque cible et chaque point de concentration. Les résultats ont été évalués comme discuté ci-dessus.
Pour vérifier initialement la spécificité des produits de PCR, l'ADNc dérivé de répliques biologiques de cellules HCT 116 a été regroupé et introduit dans les réactions de qPCR. Le séquençage de Sanger a été effectué pour des produits de PCR plus longs pour chaque isoforme de dUTPase. L'amorce inverse suivante, ainsi que les amorces directes appropriées pour chaque cible dUTPase, a été utilisée pour générer les produits de PCR plus longs : 5'-TGGTATTGTTGTAATCATAGGCACTGT-3'. En utilisant ces cibles comme matrices, une PCR nichée de deuxième tour a été réalisée et les produits de PCR ont été comparés aux produits de PCR à partir de réactions de PCR à tour unique avec électrophorèse sur gel d'agarose et analyse de la courbe de fusion. Pour l'électrophorèse sur gel d'agarose, de l'agarose à 2 % et du tampon courant TAE ont été utilisés. Pour chaque gène, 2 à 4 µl de produits de PCR ont été mélangés avec un colorant de charge et chargés sur le gel. GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder et GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific, SM0321) ont été utilisés comme marqueurs. Gel Doc XR + Imager a été utilisé pour l'imagerie. Une analyse de la courbe de fusion a été effectuée après chaque amplification. Dans le cas où les courbes de fusion montraient une formation de produit spécifique, les puits ont été exclus de l'analyse.
La distribution des phases du cycle cellulaire a été analysée par cytométrie en flux. Les cellules ont été traitées avec de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) à une concentration de 10 µM pendant 20 min. Les cellules ont été recueillies comme décrit ci-dessus. La coloration des cellules pour la synthèse d'ADN a été réalisée à l'aide du kit de test de cytométrie en flux Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 (Invitrogen, C10632) conformément aux recommandations du fabricant. Les cellules ont également été colorées pour la teneur en ADN avec 10 µg/ml d'iodure de propidium (Thermo Scientific) et 20 µg/ml de RNase A (Sigma, 10109142001 dissous dans 10 mM de Tris-HCl, 15 mM de NaCl, pH = 7) dans 500 µl de PBS et incuber à température ambiante pendant 30 min à l'abri de la lumière. Les échantillons ont été analysés avec un cytomètre en flux Attune NxT (Thermo Fischer Scientific Waltham, MA, US). Le signal Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor™ 488 a été détecté avec une excitation à 488 nm et une émission à 530/30 nm dans le canal BL1. Le signal Propidium-Iodure a été détecté avec une excitation à 488 nm et une émission à 695/40 nm dans le canal BL3. L'analyse des résultats a été réalisée à l'aide du logiciel Attune NxT 3.2.1.
Les cellules ont été lysées au vortex pendant 1 min dans du tampon RIPA (150 mM de chlorure de sodium, 1 % de substitut de Nonidet P-40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS, 50 mM de TRIS HCl, 2 mM de DTT, 1 mM de PMSF, 5 mM benzamidine, EDTA 2 mM) complétée par des comprimés cOmplete ULTRA (Roche) et PhosSTOP (Roche). Le lysat a été soniqué deux fois pendant 3 min avec fonction de dégazage à 4 ° C (Elma S 30 H Elmasonic) et centrifugé pendant 5 min à 4 ° C à 10621 g (Eppendorf Centrifuge 5804 R). Le surnageant a été récupéré et stocké à - 20 °C jusqu'à traitement ultérieur. La concentration en protéines des échantillons a été déterminée avec le kit d'analyse de protéines Pierce BCA (Thermo Scientific, 23227) à l'aide du lecteur de microplaques BioTek Synergy Mx. 15 µg de protéines totales ont été chargées dans chaque puits après avoir ajouté 3,5 µl de tampon de charge 5X (250 mM Tris-HCl, 50 % glycérol, 10 % DTT, 10 % SDS, 0,05 % bleu de bromophénol, pH = 6,8) et de l'eau sans RNase dans volume final de 17,5 µl. Les échantillons ont été incubés à 95 °C pendant 5 minutes et chargés sur un gel de polyacrylamide à 16 %. GRS Protein Marker Multicolor (GRiSP, GLP01.0500) a été utilisé comme échelle protéique. L'électrophorèse a été réalisée dans le système d'électrophorèse Mini-PROTEAN (Bio-Rad) dans un tampon de fonctionnement Tris-Glycine SDS (25 mM Tris – HCl, 20 mM glycine, 0, 1% SDS) à 200 V pendant 90 min. Pour le transfert, une membrane de transfert en PVDF Immobilon-P de taille de pores de 0, 45 µm (Merck, IPVH09120) a été utilisée avec un tampon de transfert (CAPS 10 mM, 15% de méthanol, pH = 11) à 250 mA pendant 3 h. La membrane a été séchée sur papier filtre et coupée après le transfert et placée dans du TBS-T (25 mM TRIS HCl, 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 0,05 % Tween-20, pH = 7,4). Le blocage et l'immunocoloration ont été réalisés dans du lait en poudre écrémé à 5 % dans du TBS-T. Après 1 h de blocage, une incubation avec des anticorps primaires a été effectuée pendant une nuit (anticorps polyclonal anti-actine (20-33) produit chez le lapin (Sigma, A5060), anticorps monoclonal anti-dUTPase produit chez le rat (Sigma, SAB4200044)). Après trois lavages des membranes pendant 10 min avec du TBS-T, une incubation avec des anticorps secondaires a été réalisée pendant 2 h à l'abri de la lumière (IgG anti-lapin (GE Healthcare, Na934vs) pour l'actine, IgG anti-rat (Sigma, A9542) pour dUTPase). Après avoir lavé à nouveau les membranes trois fois pendant 10 min avec du TBS-T, les membranes ont été placées dans du tampon TBS jusqu'à l'imagerie. Les bandes ont été visualisées avec Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Merck, WBKLS0100). L'imagerie a été réalisée avec le système d'imagerie ChemiDoc MP (Bio-Rad).
Pour l'analyse de l'expression génique, le logiciel CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad) a été utilisé (URL : https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-maestro-software-for-cfx-real -temps-pcr-instruments). La valeur seuil a été fixée uniformément à 500 unités de fluorescence relative (RFU) pour chaque plaque mesurée. Les images de gel ont été capturées avec le logiciel Image Lab 4.1 (Bio-Rad) (URL : https://www.bio-rad.com/en-hu/product/image-lab-software). Les graphiques ont été créés avec OriginPro 2018 (OriginLab Corp.) (URL : https://www.originlab.com/2018). CorelDRAW Graphics Suite 2020 (Corel Corporation) a été utilisé pour créer des figures à partir de graphiques individuels (URL : https://www.coreldraw.com/en/product/coreldraw/).
Pour évaluer la relation entre l'expression normalisée relative des isoformes de la dUTPase et l'expression globale, des comparaisons par paires ont été effectuées entre chaque lignée cellulaire normale et le groupe de lignées cellulaires cancéreuses. Les données d'expression normalisées relatives ont été extraites de CFX Maestro 2.0 (Bio-Rad). Le logarithme du rapport de l'expression normalisée relative de chaque isoforme à l'expression globale (mesurée avec la cible DUT-all) a été calculé et appelé indicateur de rapport. Comme la variance des trois échantillons biologiques répétés mesurés dans différentes lignées cellulaires n'est pas égale, nous avons effectué l'analyse non paramétrique de Kruskal – Wallis suivie de comparaisons par paires Conover-Iman avec correction de Bonferroni à l'aide de XLSTAT (Lumivero). Après correction de Bonferroni, les valeurs de p ont été définies comme étant significatives en dessous de 0,0018. Pour l'expérience de famine sérique, les valeurs p ont été calculées par le logiciel CFX Maestro.
Aucun ensemble de données n'a été généré ou analysé au cours de l'étude actuelle. Sur demande, les données brutes sont disponibles via l'adresse e-mail [email protected].
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Cette étude a été principalement soutenue par le Bureau national de la recherche, du développement et de l'innovation de Hongrie (K119493, K135231, VEKOP-2.3.2-16-2017-00013 à BGV, NKP-2018-1.2.1-NKP-2018-00005), et la subvention TKP2021-EGA-02, mise en œuvre avec le soutien du ministère hongrois de la Culture et de l'Innovation du Fonds national de recherche, de développement et d'innovation, financé dans le cadre du programme de financement TKP2021-EGA. Ce travail a également été soutenu par les fonds hongrois de recherche scientifique (OTKA-K128011 à VGy et OTKA-K128369 à AÁ). Cette étude a également été soutenue par le programme hongrois d'excellence thématique (TKP2020-NKA-26). Les auteurs reconnaissent le soutien financier du programme d'excellence des laboratoires nationaux (dans le cadre du projet de laboratoire national de tumoriologie (2022-2.1.1-NL-2022-00010 à JT)) et du programme d'excellence thématique hongrois (TKP2021-EGA-44 à JT). Les auteurs remercient Beáta Haraszti pour l'assistance technique.
Financement en libre accès fourni par l'Université de technologie et d'économie de Budapest.
Département de biotechnologie appliquée et des sciences alimentaires, Faculté de technologie chimique et de biotechnologie, Université de technologie et d'économie BME Budapest, Műegyetem Rkp. 3., Budapest, 1111, Hongrie
Gergely Attila Rácz & Beáta G. Vértessy
Institut d'enzymologie, Centre de recherche en sciences naturelles, Réseau de recherche ELKH Eötvös Loránd, Budapest, Hongrie
Gergely Attila Rácz, Nikolett Nagy, György Várady, Ágota Apáti & Beáta G. Vértessy
École doctorale de biologie, Institut de biologie, Université ELTE Eötvös Loránd, 1117 Budapest Pázmány Péter Sétány 1/C, Budapest, Hongrie
Nikolett Nagy
Département de pharmacologie expérimentale, Institut national d'oncologie, Ráth Gy. U. 7-9, Budapest, 1122, Hongrie
József Tóvári
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GAR et BGV ont conçu le projet et conçu les expériences. GAR et NN ont réalisé les expériences et analysé les résultats. BGV a supervisé le projet. JT et Á.A. a fourni des matériaux et une expertise dans la culture de lignées cellulaires normales. GV a effectué l'analyse par cytométrie en flux. GAR, NN et BGV ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit et ont fourni des commentaires critiques.
Correspondance à Gergely Attila Rácz ou Beáta G. Vértessy.
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
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Réimpressions et autorisations
Rácz, GA, Nagy, N., Várady, G. et al. Découverte de deux nouvelles isoformes du gène DUT humain. Sci Rep 13, 7760 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32970-1
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Reçu : 30 juin 2022
Accepté : 05 avril 2023
Publié: 12 mai 2023
DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-32970-1
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