La perturbation probiotique de la détection du quorum réduit la virulence et augmente la sensibilité à la céfoxitine dans la méthicilline

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 4373 (2023) Citer cet article

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Les thérapies qui ciblent les systèmes de détection de quorum (QS) qui régulent la virulence du Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) sont une alternative prometteuse aux antibiotiques. Les systèmes QS jouent un rôle crucial dans la régulation de la résistance aux antibiotiques du SARM, de la production d'exotoxines, de la protection antioxydante et de l'évasion des cellules immunitaires, et sont donc des cibles thérapeutiques attrayantes pour réduire la virulence d'un agent pathogène. Dans le présent travail, les effets des peptides bioactifs isolés de deux souches de bactéries lactiques ont été testés contre la résistance aux antibiotiques, la production de caroténoïdes, la résistance à la destruction oxydative et la structure du biofilm dans deux isolats cliniques de SARM. Les résultats obtenus à partir d'essais de concentration d'inhibition fractionnée avec des molécules bioactives en vrac et semi-purifiées ont montré un effet synergique significatif augmentant la destruction du SARM médiée par la céfoxitine. Cela a été couplé à une diminution de six fois du principal pigment membranaire, la staphyloxanthine, et à une augmentation de 99 % de la sensibilité à la destruction médiée par le stress oxydatif. L'analyse PCR quantitative en temps réel des gènes QS agrA et luxS a montré une expression différentielle entre les souches de SARM et une régulation négative significative du gène hla de l'hémolysine. La microscopie optique et la microscopie électronique à balayage ont révélé une altération de la formation du biofilm et du comportement de regroupement. Ces résultats démontrent que les métabolites bioactifs peuvent être efficacement appliqués en tandem avec des antibiotiques bêta-lactamines pour sensibiliser le SARM à la céfoxitine. De plus, ces résultats ont montré que plusieurs mécanismes de virulence clés contrôlés par QS sont diminués par les métabolites probiotiques.

L'utilisation excessive d'antibiotiques a historiquement contribué à l'augmentation des bactéries résistantes aux antibiotiques en sélectionnant les résistances émergentes1, et on ne s'attend plus non plus à ce que la dépendance aux monothérapies antibiotiques puisse suivre le rythme des souches de bactéries résistantes émergentes2,3. Une stratégie pour aider à gérer la propagation de la résistance aux antimicrobiens consiste à réduire la pression sélective qui contribue à l'apparition d'une résistance en limitant l'utilisation d'antimicrobiens établis4. Par conséquent, on se concentre davantage sur la recherche d'alternatives aux monothérapies traditionnelles d'antibiotiques3,5. En particulier, les thérapies alternatives qui interfèrent avec la détection du quorum bactérien (QS) et la communication de cellule à cellule sont une approche prometteuse pour mieux gérer la propagation de la résistance aux antimicrobiens. Les systèmes QS bactériens utilisent des mécanismes de régulation hautement sophistiqués pour faciliter la pathogenèse bactérienne en adaptant l'expression des gènes de virulence à l'environnement fluctuant de l'hôte pendant l'infection. À de faibles densités d'agents pathogènes, les molécules de signalisation utilisées pour communiquer entre les cellules ont une faible concentration, mais s'accumulent jusqu'à une concentration seuil à mesure que la densité de la population cellulaire augmente. Une fois le seuil atteint, les molécules de signalisation QS sont captées par la cellule via des transporteurs spécifiques et des régulateurs transcriptionnels sont activés qui à leur tour induisent les gènes de virulence requis à ce stade de la pathogenèse6. Les systèmes QS ne sont pas directement impliqués dans les processus métaboliques essentiels et, théoriquement du moins, ces alternatives non mortelles exerceraient une pression moins sélective sur les agents pathogènes capables d'exprimer une résistance7,8. De plus, comme les systèmes QS jouent souvent un rôle vital dans les caractéristiques et les comportements typiques des bactéries qui contribuent à leur virulence globale, comme la production de toxines et l'évasion des cellules immunitaires, les perturbateurs QS sont des candidats thérapeutiques intrigants dans la lutte contre les infections bactériennes et la septicémie9,10.

L'une de ces nouvelles alternatives qui est récemment apparue comme un concurrent pour lutter contre les bactéries pathogènes est l'utilisation de bactéries probiotiques et de leurs métabolites qui agissent comme des perturbateurs du QS8. Bien que les preuves scientifiques à l'appui des allégations des avantages des probiotiques sur la santé humaine et animale soient rares, des travaux récents ont élucidé plusieurs mécanismes par lesquels les probiotiques agissent pour interférer directement avec la virulence des agents pathogènes. Il a été démontré que les peptides métaboliques produits par Lactobacillus acidophilus réduisent la virulence des souches bactériennes pathogènes en réduisant leur utilisation du QS pour détecter et communiquer dans leur environnement : un contributeur crucial à la capacité de l'agent pathogène à produire des toxines, à envahir les cellules hôtes, à échapper aux cellules immunitaires et forment des biofilms11,12. Il a également été démontré que les métabolites isolés du milieu usé sans cellule (CFSM) des cultures de Bifidobacterium régulent à la baisse les principaux gènes régulateurs contrôlant les facteurs de virulence nécessaires à la fixation et à l'adhésion chez Salmonella enterica sérotype Typhimurium et Escherichia coli entérohémorragique O157:H713,14. Notamment, il a été démontré in vivo que le probiotique Bacillus subtilis produit des métabolites d'extinction du quorum qui ont contribué de manière significative à l'exclusion du pathogène commensal Staphylococcus aureus dans l'intestin des populations rurales thaïlandaises15.

Staphylococcus aureus est un agent pathogène à Gram positif très préoccupant. Les bactéries Gram-positives utilisent des oligopeptides autoinducteurs dans des systèmes d'expression génique contrôlés par QS intercellulaires, et la communication via ces autoinducteurs imperméables est médiée par des récepteurs spécialisés. La voie du régulateur de gène accessoire (agr) est l'un des systèmes QS les mieux décrits chez S. aureus, comprenant un récepteur histidine kinase à deux composants (AgrC) et son régulateur de réponse transcriptionnelle (AgrA)16. Le système agr est influencé par la densité de la population cellulaire et régule l'expression de la virulence requise par S. aureus aux différents stades de l'infection17. Il a également été démontré qu'AgrA possède une capacité de détection d'oxydation qui est essentielle dans la défense de S. aureus contre le stress oxydatif et l'évasion des cellules immunitaires18, et que le système agr est essentiel dans la régulation dépendante de la densité des exotoxines telles que l'alpha-hémolysine et la surface cellulaire. expression protéique19,20. Des recherches antérieures ont également montré que le système agr affiche un effet régulateur significatif sur le gène mecA qui contrôle la résistance à la méthicilline chez les S. aureus (SARM) hautement virulents et résistants à la méthicilline21,22,23. Ainsi, il a été proposé que le système agr soit considéré comme un candidat important pour la perturbation du QS et une nouvelle intervention thérapeutique chez S. aureus9. Un deuxième système régulé par QS est le facteur sigma alternatif B (sigB), qui module les systèmes de réponse au stress de nombreuses bactéries Gram-positives, y compris S. aureus. SigB régule également les traits de virulence tels que la biosynthèse des caroténoïdes et les mécanismes de résistance aux antibiotiques24. De plus, la suppression de sigB dans une souche de SARM a entraîné une sensibilité accrue aux antibiotiques actifs sur la paroi cellulaire tels que la méthicilline et l'oxacilline25. Ainsi, une idée intrigante est l'application de molécules non antibiotiques perturbant le QS en combinaison avec des antibiotiques établis en tant que nouvelle thérapie combinée.

Il est proposé que les perturbateurs QS produits par les bactéries probiotiques pourraient être utilisés dans la lutte contre la résistance antimicrobienne en aidant les antibiotiques inefficaces à revenir à des états plus efficaces contre certaines souches de SARM. De plus, en raison de la présence réglementaire globale de plusieurs systèmes QS dans le SARM, la perturbation des facteurs régulés par le QS qui contribuent grandement à la virulence du SARM (par exemple, la survie des oxydants) peut également être obtenue par ces métabolites probiotiques. Pour analyser les capacités potentielles des composés probiotiques dans la réduction de la virulence, le milieu épuisé sans cellules (CFSM) de la bactérie lactique probiotique (LAB) Enterococcus faecium NCIMB 30616 ("Ef 30616") a été sélectionné. Une deuxième souche probiotique de bactéries lactiques, Lactococcus lactis ATCC 11454 ("Ll 11454"), a également été étudiée pour déterminer si l'effet était conservé parmi de nombreuses espèces probiotiques. De plus, deux souches isolées cliniques de SARM ont été sélectionnées comme cibles pour comparer la réduction de plusieurs facteurs de virulence clés bien décrits dans les populations de SARM hautement virulentes20 : la synthèse de staphyloxanthine et de caroténoïdes23, la production d'alpha-hémolysine, l'augmentation de la survie au peroxyde d'hydrogène et la résistance à la destruction des oxydants23,26, la possession de l'élément génétique mobile Staphylococcal cassette chromosome (SCC) contenant les gènes de la machinerie de résistance aux antibiotiques et la régulation et l'expression du gène mecA situé sur le SCC9,17,21,22,27.

Pour étudier les effets du matériel probiotique, les concentrations minimales inhibitrices individuelles (CMI) de deux souches cliniques de SARM, la souche 81M ("MRSA 81M") et la souche 414M ("MRSA 414M") ont d'abord été déterminées contre l'antibiotique bêta-lactame céfoxitine, et qui ont donné des CMI de céfoxitine de 100 µg/mL et 60 µg/mL pour chaque souche, respectivement. La céfoxitine a été sélectionnée pour cette étude car il a été démontré que cet antibiotique régule fortement à la hausse la voie SSC mecA (PBP2a) pour la résistance aux antibiotiques dans les souches de SARM28. L'ajout de trois concentrations de CFSM en vrac Ef 30616 stérilisé sur filtre contenant des métabolites bioactifs (5, 30 et 60 mg/mL) a été ajouté en damier à une gamme de concentrations de céfoxitine (0 à 100 µg/mL) avec des inoculums de départ égaux de chaque souche de SARM respective. Les résultats indiquent une diminution dépendante de la concentration de la concentration minimale de céfoxitine requise pour réduire la densité cellulaire de SARM de plus de 90 % lorsqu'elle est incubée avec les métabolites bioactifs pendant 24 h (Fig. 1a, b). L'indice de concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) a été utilisé pour évaluer la puissance de la combinaison du composé bioactif non antimicrobien avec la céfoxitine29. Le FIC est une expression mathématique utilisée pour décrire les effets des combinaisons de deux ou plusieurs antibiotiques ou d'un antibiotique et d'un composé non antibiotique ; les effets peuvent être décrits comme antagonistes, indifférents, additifs ou synergiques selon la définition de l'indice FIC30. L'indice de critères pour déterminer les résultats des calculs FIC entre la céfoxitine et le matériau bioactif Ef 30616 a été mis en œuvre comme suit : un résultat synergique a été observé si la combinaison dépassait les effets additifs observés des composants individuels (FIC ≤ 0,5), un résultat additif a été observé à la somme des effets des composants individuels (FIC> 0,5–1,0), un résultat indifférent a été observé si la combinaison était égale à l'effet observé du composant le plus actif (FIC> 1,0–2,0), et un antagoniste résultat a été observé lorsque la combinaison des deux composés avait un effet réduit par rapport au composant individuel le plus actif (FIC > 2,0). Les FIC obtenus pour les SARM 81M et 414M montrent une relation inverse pour les valeurs de FIC avec une concentration croissante de métabolites bioactifs Ef 30616 (Fig. 1c). Seule la souche 81M a montré des valeurs de FIC synergiques à toutes les concentrations de CFSM testées, avec une diminution significative de la CMI à 30 et 60 mg/ml par rapport au témoin CFSM non traité (p < 0,0001, test de comparaison multiple de Dunnett). Cependant, la souche 414M n'a eu que des effets additifs et n'a pas conduit à une CMI significativement différente quelle que soit la concentration de CFSM utilisée. Par conséquent, les deux souches de SARM dans cette étude ont une sensibilité différente au matériau bioactif lorsqu'elles sont traitées avec de la céfoxitine, indiquant des différences spécifiques à la souche en réponse au CFSM et/ou à la résistance aux antibiotiques.

Diagrammes thermiques du pourcentage d'inhibition de la croissance de la CMI des deux souches cliniques représentatives de SARM par des tests combinés de l'antibiotique bêta-lactame céfoxitine (0 à 100 µg/mL) et des métabolites bioactifs Ef 30616 (0, 5, 30 et 60 mg/mL) : (a) Courbes de chaleur MIC de MRSA 81M et (b) Courbes de chaleur MIC de MRSA 414M. ( c ) Valeurs de l'indice FIC pour les effets combinatoires des métabolites bioactifs EfMSI1 et de la céfoxitine pour les souches de SARM 81M et 414M. (d) Tracé thermique du pourcentage d'inhibition de la croissance du SARM 81M pour le test combiné de la céfoxitine (0 à 100 µg/mL) et des métabolites bioactifs Ef 30616 (30 mg/mL) MWCO 3000 filtrat (c'est-à-dire < 3000 Da) et rétentat ( c'est-à-dire > 3000 Da) (n = 3). Les moyennes des répliques biologiques sont indiquées pour les cartes thermiques et sont présentées comme les moyennes en termes de pourcentage d'inhibition de la croissance (ANOVA, p < 0,05 test de comparaison multiple de Dunnett).

Suite à la détermination des valeurs FIC, MRSA 81M a été sélectionné pour d'autres tests MIC car il a une plus grande sensibilité au matériau bioactif (voir ci-dessus) et a montré des valeurs FIC synergiques à toutes les concentrations testées alors que MRSA 414M n'a pas exprimé un modèle similaire. La concentration de 30 mg/mL de matériau bioactif a été sélectionnée car il s'agissait de la concentration la plus faible qui avait une valeur FIC bien inférieure à 0,5. Le matériau bioactif Ef 30616 a été divisé en deux fractions à l'aide d'un filtre centrifuge à seuil de poids moléculaire (MWCO) de 3 000 daltons (Da), la première fraction ne contenant que le filtrat (< 3 000 Da) et la seconde fraction ne contenant que le filtrat lavé et rétentat remis en suspension (> 3000 Da). Une méthode en damier a de nouveau été utilisée pour déterminer la CMI de la souche MRSA 81M en utilisant la même combinaison de concentrations de céfoxitine (0 à 100 µg/mL) avec un inoculum de départ égal, et un modèle similaire de CMI réduite a été observé dans le filtrat (Fig. 1d).

Il était nécessaire de confirmer que la réduction des valeurs de CMI MRSA 81M observée avec le CFSM en vrac et fractionné était due aux peptides bioactifs, et non aux molécules inhibitrices produites par les LAB telles que les acides organiques. La chromatographie d'exclusion de taille préparative (SEC-FPLC) a été utilisée pour séparer le CFSM en vrac en fractions contenant des métabolites spécifiques, avec de petits peptides éluant dans la fraction quatre ("fraction peptidique"). Chacune des fractions SEC a été remise en suspension à une concentration équivalente à 5, 15 ou 30 mg/mL du CFSM d'origine et testée dans un titrage en damier avec de la céfoxitine pour déterminer l'effet sur les CMI MRSA 81M. Si une ou plusieurs des fractions sont enrichies en métabolites bioactifs, un fort effet additif ou synergique devrait être observé même avec de faibles concentrations du matériau.

Les résultats indiquent que la fraction quatre d'Ef 30616 était capable de réduire les CMI MRSA 81M d'une manière dépendante de la concentration (Fig. 2a). Les valeurs de l'indice FIC étaient synergiques à 15 et 30 mg/mL de matériau et additives à 5 mg/mL (Fig. 2b). Comme cette fraction ne contient pas d'acides organiques, on peut conclure que les effets sont dus aux petits peptides bioactifs qu'elle contient. Il a également été constaté que la fraction trois diminuait les valeurs de MIC 81M, mais cela n'était synergique qu'à la concentration la plus élevée utilisée (Fig. 2b, Fig. S1 supplémentaire). Ni les fractions un ni deux n'ont eu d'effet sur la CMI bactérienne (Fig. S1 supplémentaire), confirmant en outre que les petits peptides sont les molécules bioactives responsables de la diminution de la résistance du SARM 81M à la céfoxitine.

Diagrammes thermiques du pourcentage d'inhibition de la croissance de la CMI du SARM 81M en association avec la céfoxitine (0–140 µg/mL) et la fraction SEC quatre de (a) Ef 30616 ou (b) Ll 11454 à 5, 15 et 30 mg/mL de volume équivalent matériel. (c) Valeurs d'indice FIC pour Ef 30616 fractions un à quatre et (d) Ll 11454 fractions un à quatre. Les moyennes des répliques biologiques sont indiquées pour les cartes thermiques et sont présentées comme les moyennes en termes de pourcentage d'inhibition de la croissance (ANOVA, p < 0,05 test de comparaison multiple de Dunnett).

Le matériau bioactif fractionné d'une deuxième bactérie probiotique, L. lactis 11454, a également été testé contre le SARM 81M dans un test FIC et il a également été constaté que la fraction peptidique réduisait les valeurs de CMI (Fig. 2c). Il y avait des effets synergiques des peptides Ll 11454 et de la céfoxitine à toutes les concentrations testées, entraînant une diminution significative de la CMI par rapport au témoin non traité (Fig. 2d) (p <0, 0001, test de comparaison multiple de Dunnett). Fait intéressant, bien que la fraction Ef 30616 quatre contienne moins de matière protéique que la fraction Ll 11454 équivalente, la matière Ef 30616 réduit toujours de manière significative la croissance du SARM 81M dans la céfoxitine, ce qui suggère que les peptides responsables de l'effet sont puissants à de faibles concentrations et ne constituent qu'une petite partie. de la protéine totale dans le matériau. À partir de ces résultats, il est démontré que de petits peptides bioactifs résultant de la fermentation probiotique peuvent réduire la résistance aux antibiotiques du SARM.

Des populations de variantes de petites colonies (SCV) peuvent apparaître dans les cultures de S. aureus lorsque les cellules sont exposées à des facteurs de stress environnementaux tels que les antibiotiques31. De tels SCV ont été observés lorsque des cultures traitées bioactives de SARM ont été étalées sur des plaques de gélose au sang. Après une incubation de 24 h à 37 ± 1 °C, l'ensemencement de SARM 81M traité par un bioactif a révélé de petites colonies blanches avec peu ou pas d'anneaux d'hémolyse visibles ; comparativement, les colonies de type sauvage 81M non traitées étaient pour la plupart uniformes et conservaient leur coloration orange distincte et leur phénotype hémolytique (Fig. 3a, b). Au total, 30,9 % des colonies de SARM 81M avaient complètement perdu leur pigment orange et apparaissaient sous forme de SCV. Un schéma similaire a été observé pour le SARM 414M, cependant, seulement 19,5 % des colonies totales comptées avaient perdu leur pigmentation (Fig. 3c). Le phénotype SCV a été conservé lorsque le SCV traité bioactif d'origine a été re-strié et cultivé sur des plaques de gélose au sang (Fig. S2 supplémentaire). Tous les contrôles étaient négatifs pour la croissance ou la contamination sur la gélose au sang.

(a) Colonies de SARM 81M se développant sur de la gélose au sang après traitement avec 30 mg/mL de matériau bioactif Ef 30616 (à gauche) ou pas de traitement (à droite) et (b) colonies de SARM 414M se développant sur de la gélose au sang après traitement avec 30 mg/ml Matériau bioactif Ef 30616 (à gauche) ou sans traitement (à droite). Les flèches indiquent les SCV dépourvus de pigmentation caroténoïde et d'hémolyse réduite. ( c ) Pourcentage de SCV dans les colonies de type sauvage pour MRSA 81M (n = 3) et MRSA 414M (n = 3) après 24 h d'incubation à 37 +/- 1 ° C avec et sans matériau bioactif Ef 30616 (30 mg / mL) (U = 0 ; p < 0,05 ; Mann–Whitney). Les barres noires centrales indiquent la moyenne, et les moustaches supérieures et inférieures indiquent respectivement le maximum et le minimum.

Il a été observé qu'après une incubation de 24 h à 37 ° C ± 1 ° C avec les métabolites bioactifs Ef 30616, les cellules de la souche 81M présentaient une réduction globale significative de la coloration orange (Fig. 4a); tandis que MRSA 414M présentait très peu de pigmentation (Fig. 4b, c). La quantification des caroténoïdes par extraction au méthanol et les mesures d'absorbance à 450 nm (A450) ont corroboré l'observation visuelle car il y avait une différence significative d'un facteur six dans la concentration en caroténoïdes telle que mesurée par l'absorbance entre les traitements des cellules 81M, mais moins de trois fois la différence dans caroténoïde entre les traitements des cellules MRSA 414M (U = 0; p <0, 05; Mann – Whitney) (Fig. 4d). Avec une synthèse réduite des caroténoïdes, on a émis l'hypothèse que les métabolites bioactifs Ef 30616 augmenteraient la sensibilité des souches de SARM à la destruction des oxydants. Du peroxyde d'hydrogène a été ajouté à 1,5 % v/v aux cultures non traitées et traitées bioactivement de chaque souche de SARM respective et incubées à 37 °C ± 1 °C pendant 1 h dans une solution de PBS ; le nombre de cellules (CFU/mL) a été déterminé avant et après l'incubation de 1 h (Fig. S3 supplémentaire). Les cellules bioactives traitées ont montré une mort cellulaire de 99,67 % et > 99,99 % pour les souches de SARM 414M et 81M, respectivement (W = 0 ; p < 0,05 ; rang signé Wilcoxon) ; par opposition aux cellules 414M et 81M non traitées, qui ne présentaient que 16, 67% et 19, 70% de mort cellulaire, respectivement (Fig. 4e). Cependant, la réduction du 414M non traité n'a pas été jugée significative (W = 5 ; p > 0,05 ; Wilcoxon signé-rank).

Les granulés de cellules SARM manquent de pigmentation caroténoïde après 24 h d'incubation avec le matériau bioactif Ef 30616 (30 mg/mL) à 37 °C ± 1 °C : (a) granulés MRSA 81M non traités (à gauche) et MRSA 81M traités bioactifs (à droite), (b) granules de SARM 414M non traité (à gauche) et granules de MRSA 414M traitées bioactives (à droite), et (c) comparaison des quatre granules (de gauche à droite) MRSA 81M non traité, MRSA 81M traité bioactif, MRSA 414M non traité, et SARM 414M traité bioactif. ( d ) Mesure de l'absorbance des caroténoïdes à 450 nm (A450) de chacun des deux traitements décrits pour les deux souches (n = 3) (U = 0; p <0, 05; Mann – Whitney). (e) Pourcentage de diminution de la survie des staphylocoques à 1,5 % v/v de peroxyde d'hydrogène pour le SARM 81M (n = 3) et le SARM 414M (n = 3) après 1 h d'incubation à 37 °C ± 1 °C dans une solution PBS avec et sans Traitement bioactif Ef 30616 (30 mg/mL) (W = 0 ; p < 0,05 ; rang signé Wilcoxon). Les barres noires centrales indiquent la médiane et les coiffes supérieure et inférieure des moustaches indiquent respectivement le maximum et le minimum pour les diagrammes en boîte (d) et (e).

Une analyse de l'expression relative de l'ARNm a été réalisée pour indiquer la relation entre QS et l'expression du gène de virulence potentiellement impactée par le matériau bioactif Ef 30616 (Fig. 5). Comme de nombreux systèmes liés au QS, y compris sigB, se sont révélés plus fortement activés aux stades de croissance exponentiels tardifs24, l'expression a été surveillée pour les gènes sélectionnés à la phase exponentielle tardive et stationnaire précoce pour les souches respectives. Le système QS régulateur de gène accessoire (Agr) n'a pas montré d'expression différentielle significative par rapport au contrôle non traité pour le régulateur de réponse transcriptionnelle argA. Le gène asp23 a été surveillé en tant qu'indicateur de l'activité de SigB, comme décrit précédemment32 et les résultats indiquent que les métabolites probiotiques Ef 30616 interfèrent légèrement avec les gènes clés liés à la détection de quorum via SigB dans les souches de SARM 414M et 81M.

Expression différentielle des gènes liés à la virulence du SARM par rapport aux témoins non traités des souches de SARM 81M et 414M après incubation avec le matériel bioactif Ef 30616 (30 mg/mL) à 37 °C ± 1 °C ; les cultures ont été incubées jusqu'à la phase exponentielle tardive et la phase stationnaire. L'ARNr 16s a été utilisé comme gène de ménage. Les données sont présentées sous forme de moyennes et les barres indiquent l'écart type (n = 3). Différences statistiquement significatives entre les souches indiquées par des astérisques (ANOVA ; p < 0,05).

L'expression de hla, codant pour l'alpha-hémolysine, était fortement régulée négativement en phase stationnaire, en particulier dans la souche 414M. Cela confirme en outre que les métabolites bioactifs réduisent l'hémolyse, comme cela a été observé avec les VCS sur des plaques de gélose au sang. Fait intéressant, crtM, qui code la déshydrosqualène synthase responsable de la catalyse de la première étape de la biosynthèse de la staphyloxanthine, semblait avoir une légère régulation à la hausse dans la souche 81M au début de la phase stationnaire, tandis que 414M avait un très faible niveau de régulation à la baisse. Les résultats de la qPCR démontrent des différences dans l'expression des gènes de virulence entre les deux souches de SARM en réponse au traitement avec un matériau bioactif.

Les souches MRSA 81M et 414M incubées avec et sans 30 mg/mL des métabolites probiotiques ont été évaluées par microscopie optique et microscopie électronique à balayage (MEB) après 4, 6 et 24 h d'incubation à 37 °C ± 1 °C. L'imagerie SEM a montré que les souches MRSA 81M et 414M traitées bioactives ont commencé à s'agréger à 6 h d'incubation et à former progressivement des structures multicouches (Fig. 6d – f, j – l), par rapport aux cellules non traitées (Fig. 6a – c, g – je). La microscopie optique a en outre montré que les cellules SARM traitées par bioactif commençaient à se rassembler et à former des amas plus proéminents (Fig. 7d – f, j – l). En revanche, les cellules SARM non traitées formaient des grappes typiques de type raisin sans former de grappes multicouches (Fig. 7a – c, g – i). De plus, le traitement avec le composé bioactif n'a pas semblé affecter la forme ou la taille des cellules : les cellules individuelles MRSA 81M et 414M non traitées et traitées bioactives sont apparues comme coccoïdes.

Microscopie électronique à balayage indiquant la progression de la formation de biofilm des cultures MRSA 81M et 414M non traitées et traitées bioactivement incubées sur une période de 24 h à 37 °C ± 1 °C et imagées aux intervalles suivants : images MRSA 414M non traitées en (a) 4 h, (b) 6 h et (c) 24 h, Ef 30616 SARM 414M traité bioactif à (d) 4 h, (e) 6 h et (f) 24 h, SARM 81M non traité à (g) 4 h , (h) 6 h et (i) 24 h, et Ef 30616 SARM 81 M traité bioactif à (j) 4 h, (k) 6 h et (l) 24 h. Grossissement = 4000×. Barre d'échelle = 20 µm.

Images de microscopie optique de différents stades de croissance des cultures de SARM 81M et 414M non traitées et traitées par bioactif Ef 30616 incubées sur une période de 24 h à 37 °C ± 1 °C et imagées aux intervalles suivants : SARM 414M non traité à (a) 4 h, (b) 6 h et (c) 24 h, SARM 414M traité bioactif à (d) 4 h, (e) 6 h et (f) 24 h, SARM 81M non traité à (g) 4 h, (h ) 6 h et (i) 24 h, et Ef 30616 SARM 81M traité bioactif à (j) 4 h, (k) 6 h et (l) 24 h. Objectif = 10×. Barre d'échelle = 140 µm.

La présente étude démontre que les métabolites isolés du CFSM des souches E. faecium 30616 et L. lactis 11454 augmentent la sensibilité de deux souches cliniques de SARM à la céfoxitine, un antibiotique bêta-lactamine qui n'est plus cliniquement adapté contre les infections à SARM. Comme la céfoxitine agit en empêchant la réticulation des couches de peptidoglycane dans la paroi cellulaire bactérienne, l'impact des métabolites bioactifs probiotiques sur les composants de la paroi cellulaire est synergiquement bénéfique pour le mécanisme d'action de la céfoxitine. Nos données indiquent que les peptides bioactifs de E. faecium Ef 30616 et L. lactis 11454 peuvent agir comme des adjuvants non antimicrobiens en conjonction avec un antibiotique et, de manière critique, peuvent avoir le potentiel de « resensibiliser » le SARM à des antibiotiques qui ne sont plus cliniquement pertinents comme la céfoxitine. De plus, nos résultats indiquent également que ces bioactifs Ef 30616 peuvent entraver les traits de virulence qui favorisent les infections à SARM : résistance aux espèces d'oxygène, biosynthèse de staphyloxanthine ainsi que production d'hémolysine médiée par les systèmes QS chez S. aureus. Comme les pigments caroténoïdes contribuent grandement à l'aptitude staphylococcique, en particulier dans l'évasion des cellules immunitaires, l'inhibition de la synthèse des caroténoïdes pourrait être une cible potentielle pour une intervention thérapeutique dans les infections à S. aureus27. Enfin, l'apparition de plus grandes concentrations de SVC au sein de la population globale de SARM peut indiquer un changement dans les cellules de SARM avec une expression réduite des gènes clés liés au QS au sein de la population au cours des stades ultérieurs de croissance. Cependant, en termes d'infections à S. aureus liées au biofilm, la mise en œuvre de composés probiotiques perturbateurs du QS peut ne pas être bénéfique car l'interruption du QS a montré des avantages dans la sélection des SVC et la formation globale du biofilm6,33.

Les valeurs FIC pour MRSA 81M ont indiqué qu'il y avait un effet combinatoire synergique pour les trois concentrations de matériau bioactif Ef 30616, tandis que les valeurs FIC pour MRSA 414M n'ont montré un effet synergique qu'à la concentration la plus élevée utilisée. Ces résultats indiquent des différences spécifiques à la souche dans la sensibilité à l'antibiotique pour les deux souches de SARM. Les puits de contrôle bioactifs uniquement n'ont montré aucun effet négatif sur la croissance du SARM pour les deux souches, ce qui indique que le mécanisme d'action des métabolites bioactifs n'est pas intrinsèquement antimicrobien contre le SARM, et que l'inhibition de la croissance du SARM n'a été observée que lorsque les métabolites bioactifs Ef 30616 étaient combinés avec céfoxitine. Les résultats de CMI des fractions bioactives montrent clairement que le filtrat contenait la plus grande activité et réduisait la CMI de la céfoxitine ; cependant, une certaine activité résiduelle a été détectée dans le rétentat, ce qui a entraîné une CMI légèrement inférieure à celle du témoin non traité. De plus, deux lavages du rétentat qui ont été effectués ont également montré une certaine activité bioactive résiduelle (Fig. S4 supplémentaire). Ces résultats indiquent que la majorité des composés Ef 30616 contenant une bioactivité contre les deux souches cliniques de SARM testées avaient une taille d'environ ≤ 3000 Da.

En séparant le matériau en vrac en fractions chimiquement définies, il a été démontré que les peptides bioactifs étaient responsables de la réduction observée de la résistance aux antibiotiques de la souche 81M de SARM à la céfoxitine. Les filtrats CFSM et MWCO en vrac contiennent encore de nombreux composants du milieu tels que des sucres résiduels, des protéines non hydrolysées ainsi que des acides organiques résultant de la fermentation. Les bactéries lactiques sont connues pour inhiber la croissance de S. aureus par acidification de l'environnement34, et il était donc essentiel d'éliminer les acides organiques qui pourraient autrement avoir un impact sur la sensibilité de S. aureus à la céfoxitine. Bien qu'il y ait beaucoup moins de matière dans la fraction peptidique Ef 30616 par rapport à Ll 11454, l'effet était encore suffisamment fort pour provoquer une réduction synergique des valeurs de FIC. Cela suggère que ces molécules protéobiotiques peuvent agir avec des puissances extrêmement élevées, travaillant à de très faibles concentrations. Des résultats similaires ont été observés dans une étude de Kou et al.35, dans laquelle les auteurs ont découvert qu'une quantité aussi faible que 1 µg/mL d'une molécule synthétique d'extinction du quorum était capable de réduire les CMI du SARM aux antibiotiques bêta-lactamines de première génération, la nafcilline et la céphalothine. par 50 fois. De plus, ces molécules se sont révélées efficaces pour réduire la mortalité lorsqu'elles sont appliquées en association avec la céphalothine dans un modèle de bactériémie/septicémie à SARM chez la souris36. Des peptides artificiels ont également été utilisés pour améliorer la puissance des premières générations d'antibiotiques en perturbant l'enveloppe cellulaire37. Nos résultats démontrent clairement que les processus naturels de fermentation des bactéries lactiques peuvent être exploités pour générer des peptides bioactifs qui possèdent une puissante activité anti-virulence.

Le pigment doré affiché par les caroténoïdes antioxydants a été significativement réduit pour le SARM 81M et le SARM 414M après un traitement avec 30 mg/mL de métabolites bioactifs Ef 30616. Remarquablement, bien que le MRSA 414M de type sauvage possédait à l'origine très peu de pigmentation orange, le traitement avec le matériau bioactif Ef 30616 a fait perdre au MRSA 414M la majeure partie de son pigment, ce qui a donné une pastille presque purement blanche. Le changement de couleur du culot cellulaire après 24 h d'incubation avec les métabolites bioactifs Ef 30616 indique une perturbation probiotique de la structuration appropriée de la paroi cellulaire : on pense également que les caroténoïdes sont impliqués dans la stabilisation de la membrane de S. aureus pendant l'infection et la pathogenèse et dans le maintien de la rigidité cellulaire contre défenses hôtes26,38. De plus, ces composés accumulés en surface contribuent à la virulence globale de S. aureus en offrant une protection contre la photosensibilisation et la dessiccation, ainsi qu'en agissant comme de puissants antioxydants qui éteignent les espèces réactives toxiques de l'oxygène utilisées par les cellules immunitaires39. La réduction de la coloration jaune-orange caractéristique du SARM « staphylocoque doré » familièrement connu est probablement due à la perturbation des systèmes à deux composants liés au QS qui sont considérés comme essentiels à la tolérance au peroxyde d'hydrogène chez S. aureus, y compris le facteur sigma alternatif sigB . De plus, bien que les culots cellulaires aient été presque identiques en nombre total d'UFC/mL entre le contrôle non traité et les cellules SARM traitées bioactives après 24 h d'incubation, les culots cellulaires étaient moins denses et formaient des culots cellulaires plus gros (Fig. 4a – c) qui semble être le résultat de la formation avancée de biofilm suite à l'incubation du SARM avec les métabolites bioactifs du CFSM, comme l'a révélé l'imagerie microscopique (Figs. 6, 7). La perte de composants membranaires tels que la staphyloxanthine affecte l'intégrité de la membrane, entraînant des changements dans le comportement d'agrégation et la formation de biofilm. Il est intéressant de noter que, bien que les deux souches de SARM traitées avec un bioactif aient montré une progression avancée de l'agrégation et de la formation de biofilm, elles ont toutes deux montré une sensibilité accrue à la céfoxitine sur 24 h, ce qui indique que l'agrégation et la production de biofilm n'ont pas aidé les cellules SARM à se répliquer dans la présence de céfoxitine. Ces découvertes sont d'un intérêt critique car les concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques bêta-lactamines peuvent induire la formation de biofilm dans le SARM, et que ces résultats démontrent que les peptides bioactifs permettent une sensibilité accrue du SARM aux antibiotiques même pendant la formation du biofilm.

Fait intéressant, après incubation avec du peroxyde d'hydrogène à 1,5 % v/v, le SARM 81M et le SARM 414M traités bioactifs ont montré une réduction significative de la mort cellulaire à > 99,99 % et 99,67 %, respectivement, même si le pigment orange persistant semblait rester dans le bioactif. traité SARM. Cependant, ce faible niveau de pigment provenait peut-être du pigment intermédiaire 4,4′-diaponeurosporène, qui a été indiqué précédemment par une interruption sigB40. Comme le SARM 414M de type sauvage semblait avoir une faible production de caroténoïdes (par rapport au SARM 81M), une théorie alternative est que les métabolites bioactifs sont également capables de perturber le composant intrinsèque du système agr responsable de la détection des environnements oxydatifs8. En termes de production de toxines, la transcription de hla varie selon les souches de MRSA41, et la régulation à la baisse par le matériau bioactif peut se faire par un mécanisme conservé comme la détection du quorum. La réduction de hla a été phénotypiquement observée dans la croissance des colonies de SARM suite au traitement avec le matériau bioactif, qui a montré une forte réduction des anneaux d'hémolyse sur les milieux de gélose au sang pour les deux souches. De plus, la plupart des colonies présentant une hémolyse réduite présentaient des morphologies différentes de celles du SARM de type sauvage : les colonies étaient petites, à croissance lente et avaient perdu la majeure partie de leur pigmentation d'origine (Fig. 3a, b). Ces colonies ont déjà été décrites dans des cultures de SARM comme des variantes de petites colonies. La perturbation du système agr a été liée aux SVC au sein des populations de SARM de type sauvage, et dont il a été démontré qu'elles affichent une virulence réduite et une agrégation cellulaire accrue. Ensemble, ces découvertes soutiennent l'idée que certaines molécules protéobiotiques Ef 30616 peuvent perturber la synthèse typique de la paroi cellulaire dans le SARM en bloquant la production de caroténoïdes qui agit comme un antioxydant crucial, entraînant une sensibilité accrue à la destruction des oxydants.

Ces résultats démontrent que les molécules d'extinction de quorum générées naturellement ont le potentiel de lutter contre l'augmentation des bactéries multirésistantes aux antibiotiques. Il est possible que, grâce à la perturbation médiée par les protéobiotiques des structures de la paroi cellulaire du SARM telles que la staphyloxanthine, l'efficacité de la réponse immunitaire de l'hôte puisse être augmentée à mesure que les cellules bactériennes deviennent plus suspectes d'être tuées par les macrophages par la production d'espèces réactives de l'oxygène. Bien que ces résultats concordent avec nos découvertes précédentes concernant l'activité perturbatrice du QS des métabolites probiotiques trouvés dans le CFSM d'autres LAB probiotiques, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour élucider le mécanisme d'action complet de ces métabolites bioactifs. Identifier comment ces molécules entravent le contrôle de la virulence par détection de quorum aura également des implications importantes dans leur application dans un cadre clinique pour cibler une infection bactérienne. Cependant, les technologies adjuvantes développées à partir de bactéries probiotiques qui interrompent les systèmes QS de S. aureus sont des concurrents potentiellement sérieux dans la lutte contre les infections à SARM.

Une culture mère congelée de glycérol d'Enterococcus faecium 30616 (« Ef 30616 ») (précédemment identifiée comme étant la souche Lactobacillus acidophilus DSM 13241, renommée d'après l'identification microbienne MALDI-TOF) a été obtenue auprès de l'Institut canadien de recherche pour la salubrité des aliments (Université de Guelph, Ontario, Canada). Cette souche probiotique stock a été utilisée pour produire des matériaux bioactifs contenant des métabolites probiotiques pour toutes les expériences utilisées dans cette étude. Une seconde souche probiotique, Lactococcus lactis 11454 ("Ll 11454") a été obtenue auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) et utilisée pour produire un matériau contenant des bioactifs pour les tests MIC.

Deux isolats cliniques de la bactérie S. aureus, MRSA 81M SPA t008 (« MRSA 81M ») et MRSA 414M SPA t034 (« MRSA 414M »), ont été obtenus du Atlantic Veterinary College (AVC) de l'Université de l'Île-du-Prince-Édouard (Charlottetown , Î.-P.-É., Canada). La présence d'une résistance à la méthicilline via la voie du gène SCC mecA dans les deux souches a été confirmée par la diffusion du disque d'oxacilline et les amorces du gène mecA (tableau supplémentaire S1)42. Les isolats cliniques ont été maintenus sur des plaques de gélose trypsique au soja (TSA) additionnées de 5 % v/v de sang de mouton défibriné stérile (Cedarlane, Burlington, Ontario, Canada). Les cultures de SARM ont été cultivées dans du milieu Mueller Hinton ajusté aux cations BBL ™ (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, États-Unis) pour tous les tests expérimentaux.

E. faecium Ef 30616 a été inoculé dans 200 ml de milieu De Man, Rogosa et Sharpe (MRS) modifié stérilisé par filtre de 0, 22 µm (VWR International, Mississauga, Ontario, Canada). Cette culture en bouteille a été incubée sans agitation à 37 ± 1 °C pendant 18 h. La culture a ensuite été utilisée pour inoculer 4 L de milieu chimiquement défini (CDM) avec 200 g d'isolat de protéines de lactosérum (Canadian Protein) et 25 g de lactose. La culture vasculaire a été incubée statiquement à 37 ± 1 °C pendant 48 h. Après incubation, les cellules Ef 30616 ont été isolées de la phase liquide par centrifugation à 12 000 × g pendant 30 min à 4 ° C (Avanti J-20 XPI, Beckman Coulter, Canada). Le surnageant acellulaire contenant les métabolites probiotiques a ensuite été congelé à - 80 ° C et lyophilisé. Le surnageant acellulaire Ef 30616 séché a été conservé à long terme sous forme de poudre à - 20 ° C jusqu'à son utilisation.

Le surnageant séché a été pesé et remis en suspension dans un milieu Mueller Hinton ajusté en cations à la concentration souhaitée (5, 30 et 60 mg/mL). Le pH du matériau remis en suspension a été vérifié avec un pH-mètre Accumet® AE150 (Fisher Scientific, Waltham, USA) et ajusté au besoin à un pH de 7,3 ± 0,1. La solution remise en suspension a ensuite été centrifugée à 5000 x g pendant 15 min à température ambiante avec une centrifugeuse 5804 (Eppendorf, Hambourg, Allemagne). Le liquide restant a été séparé du culot de débris et filtré à travers un filtre à membrane Supor®-800 de 0,45 µm (Pall Corporation, New York, États-Unis) avec un appareil de filtration sous vide Synthware 40/35 (Kemtech America, Los Angeles, États-Unis) pour éliminer matière colloïdale restante. Le filtrat a ensuite été stérilisé par filtration à l'aide d'un filtre seringue Basix™ 25 mm 0,2 µm (Fisher Scientific, Waltham, USA). Les échantillons ont été conservés à − 20 °C jusqu'à leur utilisation.

Des filtres centrifuges Amicon® Ultra de 15 ml avec un seuil de poids moléculaire (MWCO) de 3 000 Da (Millipore Sigma, Burlington, États-Unis) ont été utilisés pour l'ultrafiltration du surnageant acellulaire probiotique remis en suspension. Après remise en suspension comme décrit ci-dessus, 10 ml du surnageant acellulaire ont été ajoutés au tube de filtre centrifuge MWCO 3000 et centrifugés à 5000 tr/min pendant 1 h. Le filtrat MWCO 3000 a été recueilli ; la fraction de rétentat restante a été recueillie en rinçant la tête de filtre deux fois avec 10 ml de milieu Mueller Hinton ajusté en cations pour chaque rinçage. Après les deux rinçages, 10 mL supplémentaires de milieu ont été utilisés pour remettre en suspension et recueillir le rétentat. Toutes les fractions collectées ont ensuite été stérilisées par filtration avec un filtre à seringue de 0,2 µm pour éliminer toute contamination. Les solutions de rétentat liquide et de filtrat MWCO 3000 ont été stockées à - 20 ° C jusqu'à leur utilisation pour les expériences.

Le surnageant séché a été remis en suspension dans de l'eau Milli-Q à une concentration de 50 mg/mL et soniqué pendant 15 min pour améliorer la solubilisation. Après remise en suspension, les échantillons ont été centrifugés pendant 20 min à 8000 x g et le filtre surnageant stérilisé avec un filtre seringue de 0,22 µm. Les échantillons ont été séparés sur une colonne préparative XK 26/100 remplie de Superdex 30 et analysés à l'aide d'un AKTA Explorer (Cytiva Life Sciences, Marlborough, États-Unis). Le matériau a été élué avec de l'acétonitrile à 10 % et de l'acide trifluoracétique à 0,1 % à un débit de 3 ml/min. La courbe d'élution a été contrôlée en mesurant le pH et l'absorbance à 280 et 214 nm. Les élutions souhaitées ont été collectées et regroupées en fractions définies puis congelées à - 80 ° C suivies d'une lyophilisation. Le matériel lyophilisé a été stocké à - 80 ° C jusqu'à ce qu'il soit utilisé.

L'antibiotique sélectionné pour le test de concentration minimale inhibitrice (CMI) dans les deux souches de SARM était la céfoxitine, comme indiqué dans les directives du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) pour le test de CMI des espèces staphylococciques43. La céfoxitine sous forme de poudre (Alfa Aesar, Haverhill, États-Unis) a été pesée avec une balance analytique et remise en suspension dans du méthanol à 10 mg/mL et stockée à - 20 °C jusqu'à utilisation.

Les tests de CMI ont été effectués conformément aux directives du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) pour les tests de CMI des espèces de staphylocoques43. Des cultures d'une nuit de chaque souche clinique respective de SARM ont été diluées 1000 fois pour obtenir environ 106 UFC/mL comme inoculation de départ. Les plages de dilution pour la céfoxitine étaient de 0 à 100 μg/mL. Les CMI des souches cliniques de SARM avec la céfoxitine ont été déterminées par microdilution en bouillon avec de la céfoxitine dans un milieu Mueller Hinton ajusté en cations dans des microplaques à fond plat standard à 96 puits Costar® (Corning® Inc., Corning, États-Unis). Des aliquotes de milieu uniquement ont été ajoutées comme contrôles de stérilité et ont été utilisées comme contrôle de fond, tandis que le puits de céfoxitine de 100 µg/mL a servi de contrôle positif de la destruction par antibiotique. Tous les volumes d'échantillons de test étaient de 200 µL par puits avec des doublons. Après la préparation des échantillons et l'aliquotage, les plaques de test MIC ont été scellées avec du parafilm et incubées à 35 ± 1 °C et 200 tr/min sous agitation pendant 24 h dans un VWR® Incubating Mini Shaker et la température a été contrôlée avec un thermomètre numérique Fisherbrand™ (Fisher Scientific, Waltham, États-Unis). Après incubation, les plaques ont été refroidies à température ambiante et la turbidité a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques SpectraMax M2 (Molecular Devices, San Jose, USA) à une longueur d'onde de 600 nm. Les concentrations les plus faibles de céfoxitine ayant entraîné une réduction de 90 % ou plus de la turbidité par rapport aux témoins de croissance positive respectifs ont été définies comme la CMI. Tous les tests de CMI ont été effectués en trois répétitions biologiques. Suite aux tests en damier MIC, en tant que souche clinique avec un MIC élevé, le SARM 81M a été sélectionné pour tester les fractions d'ultrafiltration et SEC du matériau bioactif afin de mieux élucider la taille et l'identité chimique des bioactifs. Les tests MWCO 3000 et SEC fraction MIC ont été effectués de manière identique à la méthode de test MIC décrite ci-dessus.

Des analyses de CMI en damier ont été effectuées pour trois concentrations de matériau bioactif probiotique prédéterminées afin de déterminer les effets combinatoires synergiques, additifs ou antagonistes de la céfoxitine contre les souches cliniques de SARM. Les plages de dilution du matériau bioactif étaient de 5, 30 et 60 mg/mL de surnageant acellulaire Ef 30616 lyophilisé, ou de 5, 15 et 30 mg/mL de fractions de SEC Ef 30616 et Ll 11454 lyophilisées. Les plages de dilution de la céfoxitine utilisées dans les tests FIC étaient de 0 à 100 µg/mL pour les matériaux en vrac et de 0 à 140 µg/mL pour les fractions SEC. Les tests FIC ont été effectués de manière identique à la méthode de test MIC décrite ci-dessus. L'indice FIC a été déterminé comme décrit précédemment30. Les équations (1) et (2) ont été utilisées pour déterminer les valeurs FIC pour la céfoxitine ou chaque matériau bioactif, et l'équation. (3) a été utilisé pour calculer l'indice FIC afin de déterminer l'effet combinatoire des deux composantes.

où FICA et FICB sont les valeurs FIC pour le médicament A et le médicament B, respectivement. MICA et MICB sont les CMI respectives du médicament A et du médicament B seuls. MICC est la CMI du médicament A et du médicament B en combinaison. L'indice FIC (FICi) est la somme de FICA et FICB.

Pour les tests physiologiques et qPCR suivants, chaque souche de SARM respective a été cultivée comme suit. Chaque souche de SARM a été inoculée dans 10 mL de milieu Mueller Hinton ajusté en cations (« non traité ») et 10 mL de milieu Mueller Hinton ajusté en cations additionné de 30 mg/mL de matériel bioactif probiotique (« traité ») puis incubé à 37 ± 1 °C et 200 tr/min sous agitation pendant 24 h sauf indication contraire.

Les échantillons ont été préparés comme décrit ci-dessus. Après incubation, les caroténoïdes staphylococciques ont été extraits à l'aide d'un protocole d'extraction au méthanol préalablement établi23. Le surnageant contenant les caroténoïdes extraits a été pipeté dans 200 µL (avec des doublons) dans une plaque standard à 96 puits et l'absorbance à une longueur d'onde de 450 nm (A450) a été mesurée avec un lecteur de microplaque SpectraMax M2 (Molecular Devices, San Jose, USA ).

Les échantillons ont été préparés comme décrit ci-dessus. Après incubation, les échantillons ont été centrifugés à 4 000 tr/min pendant 15 min, lavés dans une solution PBS 1 × Dulbecco (VWR Life Science, Radnor, États-Unis) et remis en suspension à environ 109-1 010 UFC/mL dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 1,5 % v/v. Des tests de sensibilité aux oxydants ont ensuite été effectués selon un protocole préalablement établi23.

Les échantillons ont été préparés comme décrit. Des dilutions en série des échantillons ont été effectuées et 100 µL d'échantillon dilué ont été étalés en double sur des plaques TSA additionnées de 5 % v/v de sang de mouton défibriné stérile (Cedarlane, Burlington, Ontario, Canada). Les plaques ont été incubées pendant 15 à 20 h à 37 ± 1 °C et analysées pour l'hémolyse et le nombre d'UFC/mL.

Les échantillons ont été préparés comme décrit ci-dessus, puis incubés à 37 ± 1 °C et 200 tr/min sous agitation pendant 4 h et 6 h pour les échantillons de MRSA 414M et 5 h et 6 h pour les échantillons de MRSA 81M. Les extractions d'ARN des échantillons ont été réalisées selon le kit illustra™ RNAspin (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Les transcriptions inverses et les synthèses d'ADNc ont été réalisées selon le kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, Foster City, USA). Les expériences de qPCR ont été réalisées à l'aide d'un cycleur thermique CFX96™ Real-Time System C1000™ et les analyses de données ont été effectuées avec le système logiciel CFX Manager 3.1 fourni (Bio-Rad, Hercules, USA). Les gènes sélectionnés et leurs paires d'amorces sont répertoriés dans le tableau supplémentaire S1.

Les échantillons ont été préparés comme décrit ci-dessus, puis incubés à 37 ± 1 °C et 200 tr/min sous agitation pendant 4 h, 6 h et 24 h pour les échantillons 414M et 81M. Après incubation, les échantillons ont été colorés avec du Crystal Violet, préparés pour la microscopie optique et observés à l'aide du microscope Upright Revolve 4 équipé d'un iPad Pro (ECHO Inc., San Diego, USA). Les échantillons SEM ont été préparés comme décrit précédemment44. Les échantillons ont été montés sur des talons à l'aide de ruban adhésif double face et recouverts d'or à l'aide d'un système Denton Vacuum et observés avec un microscope électronique à balayage Hitachi TM3000 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japon) fonctionnant à 15 kV.

Les données MIC ont été analysées par ANOVA à deux voies suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett en utilisant la version 9 de GraphPad Prism (logiciel GraphPad, San Diego, Californie). Toutes les données qPCR ont été analysées par ANOVA à l'aide du système logiciel CFX Manager 3.1 (Bio-Rad, Hercules, USA). Les données du test d'absorption des caroténoïdes et le nombre de cellules en pourcentage du SCV ont été analysés par des tests statistiques Mann – Whitney U à l'aide de Microsoft Excel. Les données sur la destruction des cellules au peroxyde d'hydrogène ont été analysées par Wilcoxon pour des tests statistiques appariés à l'aide de Microsoft Excel. Toutes les répliques indiquées (n) sont la valeur biologique moyenne des doublons techniques.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr J Trenton McClure du Collège vétérinaire de l'Atlantique à Charlottetown, PE, Canada pour avoir fourni les souches cliniques de SARM, et Matthew Saab pour avoir facilité l'approvisionnement en souches. Les auteurs tiennent à remercier Jonathon Roepke pour son aide à la conception expérimentale et à l'exécution. Les auteurs tiennent également à remercier l'Institut canadien de recherche sur la sécurité alimentaire à Guelph, ON, Canada pour avoir fourni la souche Enterococcus faecium. Enfin, cette recherche a été financée en partie par le Conseil national de recherches du Canada dans le cadre du Programme d'aide à la recherche industrielle pour le développement technologique.

Department of Mechanical Engineering, École de Technologie Supérieure (ÉTS), Montreal, QC, H3C 1K3, Canada

Monica Angela Cella, Sara Badr et Ali Ahmadi

MicroSintesis Inc., Victoria, PE, COA 2G0, Canada

Thomas Coulson, Samantha MacEachern, Mahdis Sadat Tabatabaei & Alain Labbe

Institut canadien de recherche sur la salubrité des aliments, Université de Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canada

Mansel William Griffiths

Département des sciences alimentaires, Université de Guelph, Guelph, ON, N1G 2W1, Canada

Mansel William Griffiths

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MAC a effectué les tests de cytotoxicité et les mesures des caroténoïdes. MAC et SM ont effectué les tests MIC. MST a effectué le fractionnement SEC. MAC, TC, AL et MWG ont fourni des analyses de données et un aperçu des résultats des tests. SB et AA ont réalisé l'imagerie et analysé les images de microscopie. MAC et TC ont rédigé le manuscrit et préparé les figures.

Correspondance à Thomas Coulson ou Alain Labbe.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Cella, MA, Coulson, T., MacEachern, S. et al. La perturbation probiotique de la détection du quorum réduit la virulence et augmente la sensibilité à la céfoxitine chez Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline. Sci Rep 13, 4373 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31474-2

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Reçu : 09 novembre 2022

Accepté : 13 mars 2023

Publié: 16 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-31474-2

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