Programmation d'assemblages multicellulaires avec des molécules synthétiques d'adhésion cellulaire

Nature volume 614, pages 144–152 (2023)Citer cet article

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Les molécules d'adhésion cellulaire sont omniprésentes dans les organismes multicellulaires, spécifiant des interactions cellule-cellule précises dans des processus aussi divers que le développement tissulaire, le trafic de cellules immunitaires et le câblage du système nerveux1,2,3,4. Ici, nous montrons qu'un large éventail de molécules synthétiques d'adhésion cellulaire peut être généré en combinant des interactions extracellulaires orthogonales avec des domaines intracellulaires de molécules d'adhésion natives, telles que les cadhérines et les intégrines. Les molécules résultantes produisent des interactions cellule-cellule personnalisées avec des propriétés d'adhésion similaires aux interactions natives. L'identité du domaine intracellulaire des molécules synthétiques d'adhésion cellulaire spécifie la morphologie et la mécanique de l'interface, tandis que divers domaines d'interaction extracellulaire homotypiques ou hétérotypiques spécifient indépendamment la connectivité entre les cellules. Cette boîte à outils de molécules d'adhésion orthogonales permet l'assemblage rationnellement programmé d'architectures multicellulaires, ainsi que le remodelage systématique des tissus natifs. La modularité des molécules synthétiques d'adhésion cellulaire fournit des informations fondamentales sur la manière dont des classes distinctes d'interfaces cellule-cellule ont pu évoluer. Dans l'ensemble, ces outils offrent de puissantes capacités pour l'ingénierie cellulaire et tissulaire et pour l'étude systématique de l'organisation multicellulaire.

La capacité de programmer systématiquement l'adhésion cellule-cellule fournirait de nouveaux outils puissants pour étudier le développement, la neurobiologie et l'immunologie, et pourrait faciliter la réparation des tissus multicellulaires et la conception de cellules thérapeutiques5,6 (Fig. 1a). Néanmoins, l'ingénierie de l'adhésion dans les cellules métazoaires reste un domaine sous-exploré en biologie synthétique.

a, Divers rôles fonctionnels de l'adhésion cellulaire. b, La conception conceptuelle des récepteurs synCAM. Le domaine extracellulaire d'une CAM (à gauche) est remplacé par la GFP et un nanocorps se liant à la GFP (anti-GFP ; à droite). Une commande d'attache sans ICD est également illustrée (au milieu). c, Projection maximale de × 20 images de microscopie confocale d'interfaces synCAM par paires. Barre d'échelle, 10 µm. t = 3h. Une cellule exprimant la GFP (bleue) est liée à une cellule exprimant l'anti-GFP (orange). Le domaine CAM TM et ICD pour chaque paire est indiqué (le lien est le contrôle sans ICD) (en haut). En bas, le canal GFP des interfaces ci-dessus, mettant en évidence les différences d'enrichissement en récepteurs à l'interface. Les niveaux d'expression synCAM correspondants sont indiqués dans les données étendues Fig. 1. d, Les angles de contact mesurés à partir des interfaces illustrées en a. n = 20 (attache), n = 20 (WT ECAD), n = 20 (DLL1), n ​​= 20 (JAM-B), n = 20 (NCAM-1), n ​​= 20 (ICAM-1), n = 20 (ECAD), n = 20 (ITGB1), n ​​= 20 (ITGB2), n = 15 (MUC4). Les angles de contact pour l'interaction cellule-cellule homotypique WT ECAD sont également indiqués. e, La fraction d'enrichissement en GFP à l'interface cellule-cellule de c. n = 20 (attache), n = 20 (DLL1), n ​​= 20 (JAM-B), n = 20 (NCAM-1), n ​​= 20 (ICAM-1), n ​​= 20 (ECAD), n = 20 (ITGB1), n ​​= 20 (ITGB2), n = 15 (MUC4). f, Quantification des angles de contact de cellules L929 par paires exprimant des synCAMs GFP/anti-GFP avec les affinités indiquées et en présence (bleu) ou en l'absence (noir) d'un ICAM-1 ICD. n = 20 paires. Les barres d'erreur indiquent les intervalles de confiance à 95 %. t = 3h. Les niveaux d'expression de synCAM correspondants sont indiqués dans la Fig. la ligne centrale indique la médiane, les limites de la boîte indiquent le 25e au 75e centile et les moustaches indiquent les valeurs minimales à maximales.

Données source

Les interactions cellule-cellule natives sont médiées par une grande collection de molécules d'adhésion cellulaire (CAM) - des protéines transmembranaires complexes qui se lient aux cellules voisines ou à la matrice et induisent une réponse adhésive mécanique, impliquant souvent des réarrangements du cytosquelette7,8,9,10,11. Des exemples de CAM comprennent les intégrines, qui assemblent les adhérences focales, et les cadhérines, qui assemblent les jonctions adhérentes entre les cellules épithéliales11,12,13,14. La complexité structurelle et la diversité fonctionnelle des CAM ne permettent pas de savoir si les fonctions de liaison extracellulaire et de réorganisation du cytosquelette médiée par le domaine intracellulaire peuvent être découplées et recombinées pour générer de nouvelles connectivités cellule-cellule, bien que des études antérieures indiquent le potentiel de modularité15,16,17, 18,19.

Ici, nous explorons systématiquement la modularité des CAM en fusionnant des domaines de liaison extracellulaires orthogonaux (ECD) à des domaines intracellulaires CAM endogènes (ICD), générant ainsi des CAM synthétiques (synCAM). Nous caractérisons les interfaces cellule-cellule résultantes et testons si les synCAM peuvent programmer une nouvelle organisation multicellulaire.

Nous avons généré des synCAM hétérophiles dans lesquelles une interaction de liaison orthogonale bien caractérisée - l'interaction GFP-anti-GFP (nanocorps) - est fusionnée aux DAI de la E-cadhérine (ECAD), de l'intégrine β1 (ITGB1), de l'intégrine β2 (ITGB2), la molécule d'adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1), la protéine de type delta 1 (DLL1), la molécule d'adhésion jonctionnelle B (JAM-B), la molécule d'adhésion cellulaire neurale 1 (NCAM-1) et la mucine 4 (MUC-4)20 (Fig. 1b). La région transmembranaire (TM) et l'ICD de la CAM du donneur ont été fusionnés à la GFP ou à l'ECD anti-GFP.

Nous avons ensuite testé si la synCAM apparentée associée à des DCI symétriquement appariés pouvait entraîner la formation de jonctions entre les fibroblastes de souris L929 (une lignée cellulaire à faible adhérence endogène utilisée pour évaluer le tri d'adhérence différentiel de la cadhérine)21,22. Les cellules exprimant des synCAM apparentées ont été mélangées dans une plaque à fond plat à ultra-faible attachement (ULA) et imagées à l'aide de la microscopie confocale (Fig. 1c). Nous avons comparé les interfaces pilotées par synCAM avec celles formées par des molécules d'adhésion natives (par exemple, ECAD de type sauvage (WT)) ou par une simple attache (GFP ou anti-GFP fusionnée à un domaine transmembranaire dépourvu de tout ICD). Les synCAMs / tethers ont été appariés en termes d'expression (Extended Data Fig. 1).

Plusieurs synCAMs (ICD : ECAD, ITGB1, ITGB2, ICAM-1 et MUC-4) ont formé des interfaces étendues comparables à celles observées avec la cadhérine native. Des interfaces de type natif se forment bien que ces molécules soient complètement dépourvues de leurs grands domaines extracellulaires natifs. En revanche, l'attache (pas d'ICD) ne formait pas une interface étendue, ne montrant qu'un petit point de contact.

Plusieurs autres synCAM (ICD : NCAM-1, JAM-B et DLL1) ont présenté un phénotype distinct. Les interfaces résultantes étaient petites, mais avec un enrichissement substantiel de l'interface des synCAM marqués GFP (Fig. 1c). En revanche, le signal GFP dans les paires de cellules attachées est resté distribué dans toute la membrane. Ainsi, ces synCAM entraînent un phénotype distinct de regroupement spatial enrichi à l'interface lorsqu'ils sont engagés.

Pour analyser quantitativement la géométrie de l'interface pour les interactions synCAM (15 à 20 paires de cellules), nous avons mesuré l'angle de contact, une mesure standard de la tension superficielle apparente cellule-cellule qui est corrélée à la taille de l'interface23,24,25 (Fig. 1d). Nous avons également mesuré la fraction d'enrichissement (la fraction de synCAM étiquetée GFP localisée à l'interface par rapport à la membrane totale; Fig. 1e). Ces résultats montrent deux principales classes phénotypiques de synCAM : une classe induit la formation de grandes interfaces cellule-cellule étendues (ICD : ECAD, ITGB1, ITGB2 et ICAM-1, MUC-4), et une autre classe induit la formation de petites mais des interfaces très enrichies (ICD : NCAM-1, JAM-B et DLL1) (MUC-4 et ICAM-1 présentent des comportements hybrides). Chacune de ces classes d'interfaces synCAM est distincte de la simple interaction tether.

Une forte interaction de liaison ECD et un fort couplage ICD avec le cytosquelette pourraient contribuer à la formation d'une interface cellule-cellule étroite. La modularité de synCAM permet d'étudier les contributions relatives de l'ECD et de l'ICD à la résistance de l'interface. En utilisant le synCAM ICAM-1 comme système de banc d'essai, nous avons caractérisé les interfaces cellule-cellule avec une affinité ECD variée (en utilisant une série d'affinités de nanocorps GFP) ou un ICD20 supprimé (Fig. 1f et Extended Data Fig. 1). La réduction de l'affinité ECD d'une constante de dissociation (Kd) de 0, 7 nM à 3 µM (> 103 fois) diminue progressivement l'angle de contact cellule-cellule résultant, mais même l'ECD le plus faible présente une interface considérablement élargie. En revanche, la suppression de l'ICAM-1 ICD, même en présence d'un ECD de haute affinité, perturbe complètement l'interface. Une diminution modeste similaire de l'angle de contact cellule-cellule a été observée pour les synCAM avec un ICD ITGB1 lorsque l'ECD Kd variait entre 0, 7 nM et 110 nM (données étendues Fig. 2). Ces observations sont cohérentes avec un modèle dans lequel les changements cytomécaniques médiés par les DCI ont un rôle dominant dans la détermination de la force et de la morphologie de l'interface23,24.

Nous avons également caractérisé comment la diminution de l'affinité d'interaction ECD affecte le phénotype d'enrichissement d'interface du synCAM NCAM-1. Le récepteur GFP reste fortement enrichi à l'interface même lorsque l'affinité ECD varie sur une plage de Kd = 0, 7 nM à 600 nM (Extended Data Fig. 2). Ainsi, le phénotype de l'interface enrichie semble également être largement influencé par l'identité ICD.

La prédominance de l'affinité de l'ICD sur l'ECD dans la détermination des propriétés d'adhésion a été corroborée dans les tests de tri par compétition (Extended Data Fig. 3). Ici, les cellules exprimant deux variantes différentes anti-GFP synCAM (ICAM-1 ICD) entrent en compétition pour co-trier avec les cellules « appâts » GFP synCAM. Les cellules d'affinité plus élevée trient préférentiellement avec les cellules appâts au cœur du cluster cellulaire. Ce test complémentaire indique également que l'ICD détermine principalement les préférences d'adhésion. L'expression de GFP – ICAM-1 / anti-GFP – ICAM-1 à des niveaux plus élevés a également augmenté l'angle de contact (Extended Data Fig. 4). En revanche, une expression plus élevée des attaches GFP/anti-GFP n'a pas modifié l'angle de contact.

Pour examiner plus en détail les interfaces synCAM, nous avons utilisé un test plus contrôlé dans lequel une cellule L929 exprimant une synCAM anti-GFP interagit avec une surface revêtue de GFP (Fig. 2 et Extended Data Fig. 5a). Ici, parce que la GFP de surface est immobile et ne peut pas se réorganiser, les cellules synCAM en interaction se propagent à la surface. Après 75 min, les cellules ont été fixées et colorées avec de la phalloïdine pour observer le cytosquelette d'actine. Une simple interaction anti-GFP-attache a entraîné une propagation minimale des cellules sur la surface de la GFP (Fig. 2a). Cependant, les synCAM ont une fois de plus montré deux modes de propagation distincts. Les cellules exprimant des synCAM avec des ICD d'ICAM-1, ITGB1, ITGB2 et ECAD se sont uniformément développées sur la surface de la GFP, développant une bande dense d'actine corticale le long de la périphérie cellulaire (Fig. 2b). Des études cinétiques montrent que cette propagation plus importante a une phase lente de dizaines de minutes à quelques heures, ce qui correspond à une exigence de remodelage du cytosquelette (données étendues Fig. 5b – e). Ces synCAMs génèrent une propagation « expansive » uniforme sur toute la périphérie de la cellule. En revanche, les synCAM avec les ICD MUC-4, NCAM-1 et JAM-B ont donné une morphologie en «œuf frit» - une masse cellulaire centrale plus petite était entourée de fines protubérances membranaires à la périphérie (Fig. 2c). Dans ces cas, les structures d'actine lamellipodiales et/ou filopodiales ont induit une propagation radiale «protrusive». Dans l'ensemble, ces études d'étalement de surface sont cohérentes avec nos précédentes études d'interface cellule-cellule, car les synCAM à propagation expansive conduisent également à des interfaces cellule-cellule plus grandes et à des angles de contact plus grands, tandis que les synCAM à propagation protrusive formaient des interfaces petites mais hautement enrichies.

a–c, images représentatives colorées à la phalloïdine de cellules L929 exprimant les synCAM indiquées se propageant sur une surface revêtue de GFP. Barres d'échelle, 10 µm. t = 2h. L'actine (coloration à la phalloïdine) est représentée en vert ; l'empreinte complète de la cellule (étiquette de la membrane) est indiquée en violet. Toutes les images sont présentées à la même échelle. a, La cellule L929 exprimant l'anti-GFP-tether (pas d'ICD) montre une propagation minimale. b, les cellules L929 exprimant des synCAM avec des ICD d'ECAD, ICAM-1, ITGB1 et ITGB2 montrent un phénotype de propagation expansif - la cellule se propage de manière circulaire avec de l'actine corticale à la périphérie de l'empreinte cellulaire. Voir les tests cinétiques de propagation dans les données étendues Fig. 5. c, les cellules L929 exprimant des synCAM avec les DCI de NCAM-1, JAM-B et MUC-4 montrent un phénotype de propagation protrusif (une forme d'œuf frit) - l'actine corticale ne se propager très loin, mais l'empreinte de la membrane cellulaire s'étend en une couche très mince au-delà de la cellule, souvent avec moins de circularité (c'est-à-dire de nature plus filopodiale ou lamellopodiale). d, L'empreinte complète de la cellule (bleu) et de la zone cellulaire (gris) pour la propagation cellulaire médiée par synCAM. Pour les boîtes à moustaches, la ligne centrale indique la médiane, les limites de la boîte indiquent le 25e au 75e centile et les moustaches indiquent les valeurs minimales à maximales. Zone de cellule : n = 23 (attache), n = 17 (ECAD), n = 23 (JAM-B), n = 16 (ICAM-1), n ​​= 16 (ITGB1), n ​​= 18 (ITGB2), n = 14 (NCAM-1), n ​​= 12 (MUC-4). Empreinte cellulaire : n = 22 (attache), n = 21 (ECAD), n = 19 (JAM-B), n = 23 (ICAM-1), n ​​= 16 (ITGB1), n ​​= 12 (ITGB2), n = 14 (NCAM-1), n ​​= 15 (MUC-4). e, Interactions de recrutement connues des protéines intracellulaires en aval trouvées dans les DCI CAM. Voir l'analyse mutationnelle des motifs de liaison à la CIM dans Extended Data Fig.6.

Données source

Nous avons étudié comment la propagation cellulaire induite par synCAM était modifiée par une série d'inhibiteurs à petites molécules de régulateurs d'actine distincts (Extended Data Fig. 6a). Toutes les cellules exprimant synCAM ont affiché une propagation minimale en présence de latrunculine B, qui perturbe la formation de filaments d'actine, confirmant l'importance de l'activité du cytosquelette dans tous les modes de propagation cellulaire. En revanche, l'inhibition de la contractilité avec la blebbistatine (mais permettant toujours la polymérisation de l'actine) a permis aux cellules synCAM de se propager, mais sans assemblage contrôlé d'actine dans des structures distinctes uniques aux différentes synCAM. Ce résultat met l'accent sur la compétition entre l'étalement et la contractilité corticale lorsqu'une cellule étend une nouvelle interface24,26. Pour les synCAM à propagation protrusive (par exemple, JAM-B ICD), les feuillets lamellipodiaux normalement observés à la périphérie de la cellule sont perturbés par CK666, indiquant un rôle de sa cible, le complexe ARP2/3, dans la formation de ces fines couches protrusives. structures.

Les morphologies d'interface distinctes observées ici peuvent être expliquées par les mécanismes postulés des DCI CAM (Fig. 2e). Bien qu'ils diffèrent individuellement dans les détails, les ICD expansifs (ECAD, ICAM-1, intégrines) recrutent des molécules adaptatrices telles que la β-caténine, la taline, la vinculine et les protéines ERM, qui sont censées engager le cytosquelette d'actine corticale et donc entraîner l'expansion du avant de la cellule entière12,13,27. En revanche, les DCI protrusifs (NCAM-1, JAM-B, DLL1) interagissent avec les protéines d'échafaudage PDZ ou les radeaux lipidiques, formant généralement des complexes organisés qui impliquent un regroupement ou une condensation de phase28,29,30,31. Les assemblages focalisés dans l'espace résultants peuvent alors entraîner des réponses protrusives du cytosquelette telles que la formation de filopodes et de lamellipodes en recrutant et en activant des protéines telles que N-WASP et ARP2/3. L'importance de ces domaines d'interaction ICD dans la formation de l'interface a été confirmée par l'analyse mutationnelle des motifs de signalisation clés (Extended Data Fig. 6b – h).

De nombreux CAM endogènes se lient de manière homophile (par exemple, ECAD et JAM-B), produisant une interface avec des ICD symétriques. Cependant, de nombreuses autres CAM endogènes participent à des interactions hétérophiles (par exemple, ITGB1, ITGB2 et ICAM-1), conduisant à des interfaces cellule-cellule avec différents DCI opposés. Nous avons donc utilisé la plate-forme synCAM pour étudier comment les DAI symétriques et asymétriques affectent la morphologie de l'interface cellule-cellule. Nous avons examiné toutes les paires possibles de différentes synCAM GFP-anti-GFP dans les fibroblastes L929 (Fig. 3 et Extended Data Fig. 7).

a, Projection maximale de × 20 images de microscopie confocale d'interfaces synCAM par paires (t = 3 h), montrant des ICD ECAD symétriques (à gauche), des interfaces asymétriques ECAD et tether (∆ICD) (au milieu) et des interfaces ECAD et ICAM-1 asymétriques équilibrées interfaces (à droite). Barres d'échelle, 10 µm. Les canaux mCherry et BFP (en haut) et les canaux GFP (en bas) d'images représentatives de dix paires sur trois répliques indépendantes sont affichés. b, Quantification de l'angle de contact (en haut) et de l'enrichissement en GFP (en bas) pour les interfaces synCAM asymétriques par paires. n = 10. La combinaison d'interfaces qui présentent le plus grand angle de contact ou enrichissement est encadrée en rouge. c, Exemple × 20 images de microscopie confocale d'interfaces asymétriques déséquilibrées par paires dans lesquelles une synCAM protrusive se lie à une synCAM expansive. t = 3h. Barres d'échelle, 10 µm. Des images représentatives de dix paires sur trois répétitions indépendantes sont présentées. En haut, liaison entre une synCAM anti-GFP protrusive et une synCAM GFP expansive. En bas, liaison entre une synCAM GFP protrusive et une synCAM anti-GFP expansive.

Données source

Les interfaces asymétriques avec un ICD entièrement supprimé (attache) d'un côté de l'interface présentent des interfaces considérablement perturbées - elles présentent une expansion minimale de l'interface cellule-cellule et une augmentation de l'angle de contact (Fig. 3a, b). Cependant, une grande interface asymétrique peut être formée si elle associe deux synCAM expansifs (par exemple, ECAD – ICAM-1 ou ECAD – ITGB2) (Fig. 3a, b). Ces résultats suggèrent que de grandes interfaces étendues peuvent se former avec des synCAM asymétriques si les ICD opposés produisent une interaction équilibrée. De manière analogue, les interfaces asymétriques associant deux ICD qui interviennent tous deux dans l'enrichissement en GFP (par exemple, NCAM-1 – MUC-4, NCAM-1 – JAM-B) génèrent un phénotype d'enrichissement d'interface similaire à celui des interfaces symétriques (Fig. 3a, b). Ainsi, pour former une interface productive, la séquence exacte d'un DCI opposé est moins critique que la présence de DCI avec une force et une morphologie adaptées.

Notamment, lorsque nous avons créé des interfaces hétérotypiques dans lesquelles une cellule avec une synCAM protrusive se lie à une cellule avec une synCAM expansive, les cellules ont interagi avec une morphologie cohérente - elles ont formé une interface asymétrique dans laquelle la cellule synCAM protrusive s'enroule autour de la cellule synCAM expansive ( figure 3c). Ces résultats montrent la diversité des interfaces qui peuvent être construites avec des combinaisons synCAM.

La programmation de la formation de nouveaux tissus multicellulaires de novo nécessite de dicter une connectivité cellulaire spécifique au sein d'un système multicellulaire5,32,33. Les efforts antérieurs pour contrôler orthogonalement l'assemblage multicellulaire, à la fois dans les systèmes bactériens et mammifères, ont généralement utilisé des approches d'attache de surface5,32,33,34,35. Notamment, des recherches récentes ont permis la structuration personnalisée de bactéries modifiées grâce à l'expression en surface de paires orthogonales nanocorps-antigène33. Compte tenu de la capacité des synCAM à diriger la morphologie cellulaire et la structure du cytosquelette, nous avons testé si les synCAM pouvaient être conçues avec une large gamme d'ECD orthogonaux pour également programmer rationnellement une connectivité spatiale spécifique. Nous avons constaté que les synCAM fonctionnelles pouvaient être construites avec plusieurs paires de liaison anticorps-antigène distinctes, y compris le fragment variable à chaîne unique HA-tag-anti-HA (scFv); protéine de liaison au maltose (MBP)–nanocorps anti-MBP ; Antigène de surface des lymphocytes B CD19–anti-CD19 scFv ; tyrosine-protéine kinase MET – nanocorps anti-MET ; nanocorps mCherry–anti-mCherry ; et récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) - nanocorps anti-EGFR (Fig. 4a et vidéo supplémentaire 1). L'orthogonalité des synCAM ECD distinctes a été confirmée à l'aide d'essais de co-tri, et nous avons quantifié leur efficacité à exclure les cellules WT L929 de l'assemblage multicellulaire (Extended Data Fig. 8).

a, SynCAMs hétérophiles avec des domaines de reconnaissance extracellulaire orthogonaux. La projection maximale de × 20 images d'interface cellule-cellule de microscopie confocale est montrée des cellules L929 exprimant des synCAM avec les ECD de paire anticorps-antigène indiqués et ICAM-1 (en haut) ou ITGB1 (en bas) TM / ICD. Barres d'échelle, 10 µm. t = 3h. Des images représentatives sont présentées de quatre répétitions indépendantes. Les tests expérimentaux du tri orthogonal sont illustrés dans les données étendues de la Fig. 8. Voir la vidéo supplémentaire 1 pour une analyse accélérée de la formation de l'assemblage orthogonal. b, Ingénierie d'assemblages hétérotypiques sur mesure. Projection maximale de × 20 images de microscopie confocale de cellules L929 exprimant des synCAM avec les partenaires de reconnaissance ECD indiqués. t = 2h. Les assemblages forment des motifs alternés (à gauche), en pont (au milieu) et cycliques (à droite). Des exemples d'images d'interactions cycliques isolées sont présentés. t = 2h. Une analyse en accéléré est présentée dans la vidéo supplémentaire 2. Les boîtes de probabilité de la distribution des contacts cellulaires sont présentées ci-dessous. n = 5. Barres d'échelle, 50 µm (gauche 3 images) et 10 µm (encarts). c, conception synCAM avec un ECD à glissière à leucine à liaison homophile (en haut). En bas, projection maximale de × 20 images de microscopie confocale de cellules L929 exprimant des synCAM à liaison homophile avec l'ECD Aph4 ou IF1 leucine-zipper et ICAM-1 TM/ICD (puits à fond rond ULA, 80 cellules au total). Barres d'échelle, 50 µm. t = 24h. Des images représentatives sont présentées de trois répétitions indépendantes. d, × 20 images de microscopie confocale de tri différentiel entre les cellules L929 exprimant WT ECAD ou les synCAM à liaison homophile indiquées. Barres d'échelle, 20 µm. t = 48h. Des images représentatives sont présentées avec des répliques indépendantes supplémentaires dans la Fig. 9 des données étendues. Aph4). e, Schéma de la conception des récepteurs et du test de tri différentiel des cellules L929 exprimant WT PCAD (orange) et une synCAM anti-PCAD (anti-PCAD, bleu) (à gauche). Le synCAM anti-PCAD contient un ICAM-1 TM/ICD. À droite, images de projection maximales de l'essai de tri dans lequel des cellules L929 exprimant WT PCAD (orange) ont été mélangées avec des cellules L929 parentales (en haut) ou synCAM (en bas) (bleu). Barres d'échelle, 50 µm. t = 0h et 24h. Des images représentatives sont présentées de quatre répétitions indépendantes avec des répétitions supplémentaires présentées dans les données étendues Fig. 10.

Données source

Nous avons testé si cet ensemble de synCAM hétérotypiques orthogonaux pouvait programmer des modèles de liaison cellulaire hautement spécifiques. (Fig. 4b et vidéo supplémentaire 2). Nous avons construit des assemblages avec les modèles suivants : (1) interactions hétérophiles alternées à deux cellules (A↔B) (expression d'une paire hétérophile GFP–anti-GFP synCAM dans les cellules A et B) ; (2) interactions de pontage à trois cellules (A↔B↔C) (expression de synCAM orthogonales dans les cellules A et C, et des deux synCAM complémentaires dans la cellule de pontage B); (3) trois interactions cycliques cellulaires (A↔B↔C↔A) (expression de deux synCAM orthogonales dans chacune des cellules A, B et C). Les assemblages résultants s'organisent comme dicté par les connectivités cellule-cellule définies par synCAM. L'analyse de la distribution du voisin le plus proche (à l'aide du logiciel d'analyse d'image Harmony) a montré que les interactions spécifiées par synCAM dominent l'assemblage (Fig. 4b). Dans les images agrandies avec un faible nombre de cellules, l'ensemble d'interactions cycliques peut conduire aux assemblages multicellulaires minimaux prédits de 3 et 4 (Fig. 4b). Ainsi, les combinaisons synCAM peuvent spécifier les connectivités de liaison précises entre les cellules.

Nous avons ensuite conçu des synCAM homotypiques à partir d'interactions ECD enroulées auto-dimérisantes. Nous avons utilisé les fermetures éclair à leucine Aph4 (une fermeture éclair à leucine conçue par ordinateur36) et IF1 (inhibiteur de l'ATPase bovine IF1), car nous prévoyions que leurs topologies de liaison antiparallèles pourraient favoriser stériquement les interactions intercellulaires transcellulaires par rapport à la liaison cis intracellulaire36,37. Nous avons également ajouté un domaine fibcon intermédiaire (un domaine FN3 consensus de la fibronectine) adjacent aux domaines enroulés pour fournir une séparation supplémentaire de la région juxtamembranaire, ce qui pourrait favoriser davantage les interactions transcellulaires38 (Fig. 4c).

Nous avons testé si les cellules exprimant des synCAM homophiles orthogonales pouvaient générer de manière prévisible des structures avec des compartiments séparés. Les cellules exprimant trois CAM homotypiques orthogonales différentes (WT ECAD, Aph4 – ICAM-1 ou IF1 – ICAM-1) ont été mélangées en combinaisons (Fig. 4d) et classées sur la base des structures d'assemblage résultantes. Les populations de cellules individuelles montrent un tri clair à travers leurs synCAM homophiles, mais le plus frappant est les comportements de tri hautement modulaires qui en résultent. Lorsque les types de cellules ont été mélangés par paires, nous avons observé que les cellules IF1 triaient vers le centre par rapport à ECAD ou Aph4. Les cellules ECAD et Aph4 forment une structure d'haltères à deux lobes. Ces relations sont maintenues lorsque les trois types de cellules sont mélangés, ce qui donne une structure avec un assemblage de cellules barbell ECAD – Aph4 avec des cellules IF1 au cœur (Extended Data Fig. 9 pour les statistiques d'assemblage). Ces résultats montrent comment une boîte à outils de synCAMs orthogonaux peut construire des structures auto-organisées à plusieurs compartiments avec modularité et prévisibilité.

Nous avons testé si les synCAM pouvaient s'interfacer directement avec un tissu maintenu ensemble par des molécules d'adhésion natives telles que la P-cadhérine (PCAD). Ainsi, nous avons conçu un synCAM avec un scFv anti-PCAD fusionné au DCI ICAM-1 (Fig. 4e, Données étendues Fig. 10 et Vidéo supplémentaire 3). Ces cellules synthétiques ciblant PCAD pourraient s'intercaler efficacement dans un sphéroïde cellulaire maintenu ensemble par PCAD. En revanche, les cellules dépourvues de synCAM ont été exclues et triées à l'extérieur de la structure. Ainsi, les synCAM peuvent intégrer des cellules dans des assemblages formés par des molécules d'adhésion natives.

Nous avons testé si les molécules d'adhésion synthétiques pouvaient fonctionner dans les cellules primaires et les cellules dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPS). Les synCAMs GFP / anti-GFP – ICAM-1 et les molécules GFP / anti-GFP – tether ont été exprimées dans plusieurs cellules primaires ou dérivées de cellules iPS (Extended Data Fig. 11). Lorsque les synCAM basées sur ICAM-1 sont exprimées dans des fibroblastes dermiques humains primaires, des cellules stromales mésenchymateuses humaines et des cellules musculaires lisses dérivées de cellules iPS, nous avons observé une forte localisation des synCAM marqués GFP à l'interface formée avec des cellules partenaires exprimant un anti fonctionnel apparenté. -GFP synCAM. Cette relocalisation de synCAM à l'interface cellule-cellule hétérotypique n'a pas été observée ni dans les cellules non liées (la GFP synCAM reste distribuée dans toute la cellule, pas seulement à l'interface) ou lorsqu'elle est co-cultivée avec des cellules partenaires contenant uniquement une attache anti-GFP (pas d'ICD ). Ces résultats démontrent que les synCAM s'engagent fonctionnellement dans ces différents types de cellules d'une manière qui dépend des ECD apparentés et de la présence d'ICD fonctionnellement appariés.

Nous avons examiné si l'adhérence synthétique pouvait remodeler et reconfigurer les tissus multicellulaires organisés par les CAM natifs. Par exemple, les cellules L929 exprimant WT ECAD et WT PCAD se trient différemment les unes des autres dans un assemblage bilobé6. Nous avons examiné si l'introduction d'une interaction synCAM GFP-anti-GFP pouvait forcer ces deux populations en ségrégation à s'intégrer (Fig. 5a). L'expression d'une molécule d'attache hétérotypique a converti l'assemblage bilobé en une structure à deux couches (noyau-enveloppe), qui maintient la ségrégation, mais augmente légèrement le nombre de contacts hétérophiles par rapport à l'assemblage bilobé. En revanche, l'expression des synCAMs plus forts (ICAM-1 ou ECAD ICD) a converti la structure bilobée en une structure intégrée, avec les deux types de cellules dans un seul compartiment mixte. Ces synCAM pourraient également forcer l'intégration de populations de cellules L929 triées de manière différentielle exprimant WT PCAD ou WT NCAD (Extended Data Fig. 12a, b). Ainsi, les synCAM peuvent être utilisés pour remodeler systématiquement les assemblages multicellulaires.

a, Schéma de l'expérience utilisant des synCAM pour forcer l'intégration de populations L929 à tri différentiel. Nous commençons avec les populations L929 exprimant WT ECAD (bleu) ou WT PCAD (orange), ce qui conduit à une ségrégation dans une structure binodale. L'image montre comment le tri est altéré par l'expression de l'intégration de synCAM hétérophiles avec des interactions de différentes forces (par rapport au récepteur tether). Les projections maximales de × 20 images de microscopie confocale sont affichées. Barres d'échelle, 20 µm. t = 24h. Voir la vidéo supplémentaire 3 pour une analyse en accéléré. Une démonstration similaire de l'intégration synCAM des populations de cellules séparées PCAD / NCAD est montrée dans Extended Data Fig. couche. L'ajout de synCAM GFP-anti-GFP avec des interactions de force croissante (par rapport au récepteur d'attache) conduit à un couplage mécanique croissant entre les tissus épithéliaux et sphéroïdes. Lorsqu'ils sont suffisamment forts, les deux types de cellules forment un réseau complexe en forme de réseau (ICAM synCAM). Les images montrent l'assemblage à t = 24 h. Les vues agrandies en 3D (en haut) et en projection maximale avec zoom arrière (en bas) sont affichées. Barres d'échelle, 100 µm (en haut) et 1 mm (en bas). Voir la vidéo supplémentaire 4 pour une analyse accélérée de l'évolution des tissus couplés.

Pour examiner plus en détail le remodelage tissulaire, nous avons testé si les synCAM pouvaient modifier les monocouches épithéliales, un élément fondamental de divers tissus et organes. Par exemple, la modulation de la structure épithéliale par les interactions avec les cellules mésenchymateuses est un thème commun dans le développement. Nous avons utilisé des cellules de rein canin Madin-Darby (MDCK) comme couche de cellules épithéliales de départ. Lorsqu'une population de cellules L929 exprimant PCAD est ajoutée, elles forment des grappes sphéroïdes homotypiques séparées qui se trouvent au-dessus de la couche épithéliale MDCK confluente. Les tissus épithéliaux de départ (MDCK) et sphéroïdes (PCAD-L929) présentent des interactions minimales, fonctionnant comme des assemblages indépendants (Fig. 5b).

Nous avons examiné si l'introduction d'interactions d'adhésion synthétique de pontage (en utilisant des DCE GFP-anti-GFP avec des DCI symétriques) pouvait forcer les tissus épithéliaux et sphéroïdes distincts à interagir. Lorsqu'une interaction d'attache minimale (pas d'ICD) est ajoutée, les cellules PCAD-L929 reposent étroitement sur la couche épithéliale MDCK, mais agissent toujours indépendamment, en maintenant leur structure sphéroïde séparée. Cependant, l'introduction d'un synCAM ECAD plus fort entraîne la propagation des sphéroïdes PCAD-L929 dans des bosses plus plates, ressemblant à des asters, qui contactent plus largement la couche épithéliale. Enfin, l'ajout de l'interaction de pontage synCAM ICAM-1 encore plus forte provoque un réarrangement coopératif substantiel des deux tissus (Fig. 5b, Données étendues Fig. 12c et Vidéo supplémentaire 4). Dans ce cas, les cellules L929 s'organisent en un réseau en treillis continu au-dessus des cellules MDCK. De plus, la couche épithéliale MDCK présente une confluence réduite, peut-être parce que la forte interaction de pontage entre les cellules L929 et MDCK semble tirer les cellules MDCK de la surface dans les espaces intermédiaires du réseau. Nous émettons l'hypothèse que ce tissu coopératif émerge des forces opposées des deux tissus. La forte attraction homotypique (PCAD) parmi les cellules L929 combinée à la forte interaction de pontage synthétique (synCAM) entre les cellules L929 et les cellules MDCK conduit ces deux populations à adopter un état mécaniquement équilibré. Le réseau résultant rappelle le réseau de tubes capillaires auto-organisé des cellules endothéliales activées. En bref, cette configuration de réseau semble fournir une solution qui permet aux cellules L929 de maintenir simultanément un degré élevé d'interaction homotypique, ainsi qu'un degré élevé d'interaction hétérotypique avec la couche épithéliale MDCK. Une structure de réseau en treillis émergente similaire a été observée dans une expérience analogue dans des cellules primaires (couche épithéliale intestinale primaire de souris plus fibroblastes embryonnaires de souris; Données étendues Fig. 12d). En résumé, les synCAM peuvent systématiquement coupler des populations de cellules autrement indépendantes pour produire des systèmes multicellulaires dont la mécanique coopérative produit des structures tissulaires complexes.

Ici, nous révélons le potentiel d'ingénierie de diverses molécules d'adhésion synthétiques qui partagent les principes de conception des molécules d'adhésion natives, mais qui spécifient des connectivités nouvelles et orthogonales entre les cellules. Bien que les métazoaires déploient une pléthore de CAM pour médier diverses interactions cellulaires et assemblages tissulaires, de nombreuses autres interfaces restent probablement inexploitées par l'évolution. La stratégie de conception synCAM utilisée ici intègre deux mécanismes de contrôle de l'adhésion synthétique. Premièrement, le domaine d'interaction extracellulaire spécifie la connectivité cellule-cellule (liaison), qui peut être homophile ou hétérophile avec une affinité contrôlée avec précision. Deuxièmement, le domaine intracellulaire dicte la réorganisation du cytosquelette et détermine en grande partie la mécanique et la morphologie de l'interface. L'orthogonalité et l'accordabilité de la reconnaissance du domaine extracellulaire couplées à la modularité de la sortie du domaine intracellulaire élargissent l'ensemble possible d'interfaces qui peuvent être générées. Cette boîte à outils peut donc modifier à la fois la connectivité cellule-cellule et le type d'interface résultant. En outre, le mélange de plusieurs synCAM et CAM natifs pour créer un système de cellules couplées mécaniquement peut générer des tissus avec des structures émergentes complexes.

Le large spectre de DCI d'adhésion se prêtant à l'ingénierie chimérique démontre que la fonction du domaine intracellulaire est, dans une certaine mesure, indépendante du mécanisme de reconnaissance extracellulaire endogène. Notamment, les interactions extracellulaires simples utilisées ici ne correspondent pas à la sophistication réglementaire plus élevée de nombreux ECD naturels, qui peuvent également montrer une cis-oligomérisation, une liaison de capture et des changements allostériques8,39,40,41,42. Néanmoins, les synCAM sont encore suffisantes pour assembler des interfaces cellule-cellule similaires. La modularité des CAM donne un aperçu du nombre de CAM naturels qui peuvent avoir évolué. Par exemple, les protéines avec des ECD de cadhérine se trouvent dans les choanoflagellés (les parents unicellulaires les plus proches des métazoaires), mais elles manquent des ICD métazoaires43,44. Ces protéines peuvent avoir été utilisées par les choanoflagellés pour se lier à des aliments ou à des substrats plutôt que pour l'adhésion cellule-cellule, puis cooptées plus tard pour l'adhésion cellule-cellule par recombinaison avec des domaines de signalisation intracellulaires43.

Cette étude soutient un rôle dominant du domaine intracellulaire dans la détermination du caractère des interfaces cellule-cellule médiées par CAM. Les interactions de liaison entre les cellules qui n'engagent pas le cytosquelette sont incapables de générer des interfaces fortes et étendues, quelle que soit l'affinité de liaison extracellulaire. En revanche, les synCAMs constitués de DCI qui engagent le cytosquelette facilitent une morphologie plus complexe qui dépend de l'identité du DCI de chaque côté de l'interface. Ces observations sont cohérentes avec des études antérieures suggérant que les DCI à cadhérine remodèlent la tension du cortex pour entraîner l'expansion de l'interface cellulaire et la résistance à la séparation cellulaire23,24,45,46,47,48.

Enfin, nous montrons que les synCAM fournissent une boîte à outils polyvalente pour la programmation de structures multicellulaires, soit de novo, soit en intercalant ou en remodelant des tissus formés par des CAM natives. La boîte à outils de synCAMs permet également une perturbation systématique des systèmes auto-organisés qui pourraient être utilisés pour analyser le mécanisme de divers processus de développement. À l'avenir, ces types de molécules d'adhésion modifiées pourraient potentiellement être appliquées pour résoudre des problèmes thérapeutiques tels que diriger avec précision la réparation et la régénération des tissus ou contrôler les interactions et le trafic des cellules immunitaires et neurales.

Les oligonucléotides ont été achetés chez Integrated DNA Technologies. Le réactif de clonage In-Fusion, le prémélange PCR CloneAmp HiFi, le kit de concentrateur Lenti-X et les cellules chimiquement compétentes Stellar ont été achetés chez Takara Bio. Les kits de mini-préparation et les colonnes de centrifugation ont été achetés auprès de Qiagen. Le réactif de transfection FuGENE HD a été acheté auprès de Promega. DMEM, GlutaMAX, Alexa Fluor 647 Phalloidin (A22287) et Alexa Fluor 555 Phalloidin (A34055) ont été achetés chez Thermo Fisher Scientific. Le sérum bovin fœtal (FBS) a été acheté auprès de l'installation de culture cellulaire de l'Université de Californie à San Francisco (UCSF). Des cellules de fibroblastes de souris L929 (ATCC, CCL-1) ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection. Les cellules MDCK étaient un cadeau du laboratoire Mostov de l'UCSF. Des cellules de fibroblastes dermiques primaires (CC-2511), des fibroblastes embryonnaires de souris (M-FB-481) et des cellules souches mésenchymateuses dérivées de moelle osseuse humaine (PT-2501) ont été achetées auprès de Lonza Bioscience. Des plaques multipuits Nexcelom 3D à 384 puits et à fond rond traitées à très faible attachement ont été achetées auprès de Nexcelom Bioscience. Des plaques à fond plat Cellstar Cell-Repellent Surface 384 puits ont été achetées auprès de Greiner Bio-One. Les plaques traitées par TC à fond transparent plat d'imagerie optique à 384 puits ont été achetées auprès de Corning. Les cellules souches pluripotentes humaines H9 (hPSC) (WA09) ont été achetées chez WiCell. L'EDTA (46-034-CI) et le Matrigel à facteur de croissance réduit (356231) ont été achetés chez Corning (Corning). Geltrex, hESC-qualified (A1413302), Essential 8 Flex Medium Kit (A2858501), Essential 6 Flex Medium Kit (A1516401) et Advanced DMEM/F12 (12634028) ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific. La protéine activine A recombinante humaine/souris/rat (338-AC-050) a été achetée auprès de R&D Systems. Le FBS pour cellules iPS (1701) a été acheté auprès de ScienCell. Le colorant de membrane plasmique rouge foncé CellMask a été acheté chez Invitrogen. Le réactif Phalloidin-iFluor 405 (ab176752) a été acheté chez Abcam.

Les anticorps suivants ont été achetés et dilués dans du PBS avant utilisation selon le protocole du fabricant : DYKDDDDK epitope tag Alexa Fluor 647-anticorps conjugués (1042E, lapin, R&D Systems, IC8529R, AEOB0118081, 1:100) ; Étiquette d'épitope DYKDDDDK Anticorps conjugués à Alexa Fluor 488 (1042E, lapin, R&D Systems, IC8529G, AEOA0521031, 1:100); anticorps monoclonaux de souris anti-MYC-tag (9B11) (conjugué AlexaFluor 647) (Cell Signaling Technology, 2233, 25, 1:100); anticorps monoclonaux de souris anti-HA-tag (6E2) (conjugué AlexaFluor 647) (Cell Signaling Technology, 3444, 15, 1:100); anticorps anti-HGFR/c-MET humain (95106) conjugués à AlexaFluor 488 (R&D Systems, FAB3582G, 1:50); anticorps anti-EGFR (DH8.3) (AlexaFluor 647) (Novusbio, 50599AF647, 1:50); et des anticorps anti-6×His tag (HIS.H8) (Abcam, ab18184, 1:100).

Le tri cellulaire et la cytométrie en flux ont été effectués à l'aide du trieur de cellules FACSAria II ou du cytomètre en flux LSR II (Beckton-Dickinson). La microscopie confocale a été réalisée à l'aide du microscope confocal à disque rotatif automatisé Opera Phenix avec un objectif à immersion dans l'eau × 20 dans des plaques à 384 puits; le Nikon TiE avec unité confocale à disque rotatif CSU-X1 avec objectifs à immersion dans l'huile ×60 et ×100 ; ou le Zeiss LSM 980 avec Airyscan 2 avec un objectif ×40 à immersion dans l'eau.

Toutes les constructions ont été clonées dans un vecteur pHR contenant le promoteur SFFV, la séquence consensus de Kozak et une séquence signal clivable de l'hémagglutinine de la grippe (MKTIIALSYIFCLVFA)50.

Pour concevoir les constructions synCAM, les régions transmembranaires et intracellulaires des molécules d'adhésion cellulaire ont été identifiées à partir des annotations topologiques dans UniProt51. Les gènes optimisés en codons codant pour chaque région CAM ICD et TM ont été achetés auprès d'Integrated DNA Technologies et insérés dans le vecteur à l'aide du clonage In-Fusion. Chaque région CAM TM et ICD a été fusionnée à un domaine de liaison extracellulaire (par exemple, GFP, anti-GFP) en utilisant le clonage In-Fusion (tableau supplémentaire 2). Les séquences de tous les ECD à nanocorps ou scFv ont été obtenues à partir de travaux précédemment rapportés ou de brevets accessibles au public20,52,53,54,55,56. Pour les expériences impliquant des cellules épithéliales intestinales, un site d'entrée interne du ribosome (IRES) et un gène de la puromycine-N-acétyltransférase (Puro) ont été clonés en aval des constructions GFP – ICAM-1 et GFP – tether dans le vecteur pHR. Les plasmides ont été séquencés par RF Biotech.

Le lentivirus a été généré en cotransfectant des vecteurs codant pour des protéines d'encapsidation (pMD2.G et p8.91) avec le plasmide pHR d'intérêt en utilisant le réactif de transfection Fugene 6 HD (selon le protocole du fabricant) dans des cellules HEK293T étalées dans des plaques à 6 puits à environ 70 % de confluence. Deux jours après la transfection, les surnageants viraux ont été collectés, passés à travers un filtre de 0,45 mm et utilisés immédiatement pour la transduction.

Pour la transduction des cellules primaires, le lentivirus a été concentré 20 fois en utilisant le kit Lenti-X Concentrator (Takara) selon le protocole du fabricant.

Les cellules L929 et MDCK ont été cultivées dans du DMEM contenant 10 % de FBS. Pour générer des lignées cellulaires stables, le surnageant viral (50 à 400 µl) a été dilué avec 1,5 ml de milieu et étalé directement avec des cellules (1 × 105 L929 ou MDCK) dans des boîtes à 12 puits. Puis, 24 h après l'infection, le milieu viral a été remplacé par du milieu de croissance normal et les cellules ont été multipliées dans un flacon T25. Les cellules ont été colorées pour l'étiquette d'épitope appropriée à l'aide d'un anticorps marqué par fluorescence et triées pour l'expression par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Sauf indication contraire, une population triée en vrac a été utilisée pour chaque expérience. Pour générer les lignées cellulaires GFP-ICAM-1 et GFP-tether L929 avec des niveaux d'expression réglés, le virus total ajouté aux cellules a été titré entre 50 et 400 µl, et les cellules ont été triées pour différents niveaux d'expression synCAM à l'aide de FACS. Pour les synCAM Aph4 et IF1, des populations unicellulaires ont été établies en triant les cellules individuelles dans une plaque à 96 puits.

Pour confirmer le niveau d'expression des synCAM dans chaque lignée cellulaire, les cellules ont été analysées à l'aide de FACS. Les cellules ont été détachées avec TrypLE et transférées dans une plaque à 96 puits à fond rond. Les cellules ont été culottées par centrifugation (pendant 4 min à 400 g), le surnageant a été retiré et les cellules ont été remises en suspension dans 40 ul de PBS contenant un anticorps conjugué à un colorant fluorescent. Les cellules ont été colorées pendant 50 min à 4 °C. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS et remises en suspension dans du PBS avec 5% de FBS. Les cellules ont ensuite été analysées par cytométrie en flux (BD LSR II, BD FACSDiva). Les données de cytométrie en flux ont ensuite été analysées à l'aide de FlowJo (TreeStar).

Avant de réaliser l'expérience, toutes les lignées cellulaires ont été détachées à l'aide de TrypLE, resuspendues dans 1 ml de DMEM, comptées puis diluées à 4.105 cellules par ml. Des cellules L929 exprimant de manière stable la BFP cytosolique et une synCAM GFP ont été mélangées 1:1 avec des cellules L929 exprimant mCherry cytosolique et une synCAM anti-GFP dans une plaque à fond plat de 384 puits avec une surface répulsive cellulaire (3,2 × 104 cellules, 80 µl volume total, 37 °C). A t = 3 h, les plaques ont été imagées à un grossissement x20 en utilisant la microscopie confocale à fluorescence (Phenix). Les images à projection maximale ont été exportées à partir du logiciel du fabricant (Harmony). Des paires de cellules distinctes de taille similaire ont été identifiées et les angles de contact ont été mesurés dans ImageJ. Le pourcentage d'enrichissement en GFP a été déterminé dans ImageJ en mesurant le signal GFP localisé à l'interface cellule-cellule en tant que fraction de celui présent dans la cellule entière. L'analyse des données pour l'angle de contact mesuré et les valeurs d'enrichissement a été effectuée dans Prism 9 (GraphPad).

Nous avons caractérisé le taux, la taille de l'interface et la morphologie de propagation des cellules synCAM sur une surface revêtue de GFP. La protéine GFP purifiée a été diluée à une concentration finale de 0, 5 µM dans du PBS et un volume suffisant a été appliqué (~ 100 µl) pour recouvrir la surface inférieure d'une chambre d'imagerie à fond de verre à 8 puits. Cette solution a été incubée pendant 10 min sur de la glace. L'excès de solution a été éliminé et la chambre a été rincée avec du PBS. Ensuite, la chambre a été bloquée avec une solution de 10 mg ml-1 d'albumine de sérum bovin (BSA) et 1 mg ml-1 de caséine bêta (Sigma-Aldrich) pendant au moins 1 h sur de la glace. La solution de blocage a été retirée et la chambre a été lavée trois fois avec du PBS. Lors de l'utilisation de chambres CellVis (C8-1.5HN), un anticorps anti-6 ×-His (ab18184) et 6 ×-His-tagged GFP (ab134853) ont été utilisés pour obtenir une couverture complète de la surface avec GFP. Une dilution 100× d'anticorps dans du PBS a été incubée à la surface de la chambre pendant 1 h à 4 °C. Après avoir été lavée trois fois avec du PBS, une solution de 10 µg ml-1 contenant de la GFP marquée His a été incubée sur la surface pendant 1 h à 4 °C. Ensuite, la chambre a été bloquée avec une solution de 10 mg ml-1 de BSA et 1 mg ml-1 de caséine bêta (Sigma-Aldrich) pendant au moins 1 h sur de la glace. La solution de blocage a été retirée et la chambre a été lavée trois fois avec du PBS.

Pour préparer les cellules pour le test d'étalement, les cellules L929 ont été détachées à l'aide de trypsine EDTA et remises en suspension dans un milieu de culture cellulaire. Environ 50 ul de solution cellulaire remise en suspension à partir d'un flacon T25 confluent ont été ajoutés à 200 ul de milieu de culture cellulaire et placés dans la chambre d'imagerie. La chambre a ensuite été transférée dans un microscope confocal à disque tournant équipé d'une platine de contrôle environnemental Oko Labs. Les cellules ont été imagées avec un objectif à immersion dans l'huile × 60 toutes les 3 min sur une période de 2 h. Au cours des 60 à 90 premières minutes, la propagation de cellules distinctes à la surface a été observée en surveillant les protéines fluorescentes cytoplasmiques exprimées dans le cytoplasme des cellules synCAM.

Les images ont été analysées en binarisant l'intensité pour obtenir un masque de la cellule, qui pourrait ensuite être utilisé pour calculer la surface de propagation totale (A) et le périmètre (p) de l'empreinte. Pour caractériser la morphologie de l'interface, la circularité (c = p2/4πA) a été calculée et comparée entre différents synCAMs. Ces mesures ont également été réalisées à l'aide d'un anticorps fluorescent anti-flag tag (marqueurs synCAM constructions) pour mesurer la surface et la morphologie directement à l'interface avec la lamelle. Pour comparer différentes cinétiques d'épandage, l'évolution de la surface dans le temps a été ajustée sous la forme suivante : A = bt1/4 où b est le coefficient de vitesse d'épandage. Ce modèle était auparavant utilisé pour comparer la cinétique d'étalement des cellules sur une surface adhésive26. L'analyse a été implémentée dans MATLAB (2020a).

Pour visualiser le cytosquelette d'actine, les cellules d'étalement ont été fixées et colorées pour l'immunohistochimie selon les procédures standard. Les cellules ont été fixées dans du PFA à 4 % dans un tampon de cytosquelette (PIPES 10 mM, NaCl 100 mM, saccharose 300 mM, EGTA 1 mM, MgCl2 1 mM) pendant 20 min sur de la glace. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois et perméabilisées avec une solution de Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS pendant 10 min sur de la glace et de nouveau lavées trois fois. Les cellules ont ensuite été bloquées avec 10 % de BSA dans du PBS (PBS-BSA) pendant au moins 1 h à 4 °C. Pour visualiser le cytosquelette d'actine, les cellules ont été colorées avec de la phalloïdine marquée par fluorescence (conjuguée avec des colorants fluorescents Alexa 647, 555 ou 405). Les cellules ont ensuite été imagées à l'aide d'un microscope confocal à disque rotatif en utilisant un objectif de grossissement × 100. Les périphéries cellulaires ont été déterminées par coloration avec le colorant de membrane plasmique rouge foncé CellMask (Invitrogen). Pour les mesures étudiant les effets des inhibiteurs du cytosquelette sur la propagation cellulaire, les cellules ont été introduites dans un milieu contenant l'inhibiteur et laissées se propager sur la surface revêtue de GFP (CK666 (100 µM), latrunculine B (5 µM), SMIFH2 (100 µM), inhibiteurs de blebbistatin (50 µM) ont été achetés chez Abcam). Les cellules ont ensuite été fixées et colorées selon la procédure ci-dessus avant d'être imagées à l'aide du microscope Zeiss 980 Airyscan et d'un objectif à immersion dans l'eau x40 (Zen Blue).

Avant de réaliser l'expérience, toutes les lignées cellulaires ont été détachées à l'aide de TrypLE, remises en suspension dans 1 ml de DMEM, comptées puis diluées à 1 x 103 cellules par ml. Des cellules L929 exprimant de manière stable la BFP cytosolique et une synCAM anti-GFP d'affinité variable ont été mélangées 1: 1: 1 avec des cellules L929 exprimant mCherry cytosolique et une synCAM anti-GFP d'affinité variable, et des cellules L929 exprimant GFP – ICAM-1 dans des puits distincts d'un puits à fond rond ULA de 384 puits (volume total de 80 µl). A t = 24 h, les puits ont été imagés à un grossissement x20 en utilisant la microscopie confocale à fluorescence (Phenix).

Pour quantifier l'organisation de différentes cellules exprimant synCAM dans le test de tri différentiel multicellulaire, nous avons calculé la fonction de distribution radiale g(r) à partir de piles confocales 3D multicanaux. Les cellules exprimant mCherry et BFP ont été imagées à un grossissement ×20 avec une taille de pas z de 10 µm. Chaque tranche de la pile d'images a été seuillée et binarisée pour chaque canal de couleur, et le centre de masse (COM) du cluster a été trouvé. g(r) a été trouvé en calculant la distance de chaque pixel à partir du COM et en normalisant la densité de pixels dans le cluster. Pour créer une valeur unique capturant la distribution des cellules dans le cluster, nous avons calculé le COM de la distribution g(r) et soustrait cette valeur pour les cellules mCherry de la valeur pour les cellules BFP. Les grandes valeurs indiquent donc que les cellules mCherry sont plus proches du centre du cluster et les petites valeurs indiquent que les cellules BFP sont plus proches du centre du cluster. L'analyse d'image a été implémentée dans MATLAB (2020a).

Des cellules L929 exprimant de manière stable des synCAM avec des paires hétérophiles orthogonales et un mCherry ou BFP cytosolique ont été générées. Avant de réaliser l'expérience, les lignées cellulaires ont été détachées à l'aide de TrypLE, remises en suspension dans 1 ml de DMEM, comptées puis diluées à 4 x 105 cellules par ml. Chaque paire a été mélangée 1:1 dans une plaque à fond plat de 384 puits avec une surface répulsive pour les cellules (3,2 × 104 cellules, volume total de 80 µl, 37 °C). A t = 3 h, les plaques ont été imagées à un grossissement x20 en utilisant la microscopie confocale à fluorescence (Phenix). Les images à projection maximale ont été générées à l'aide du logiciel du fabricant.

Pour valider l'orthogonalité des paires de synCAM hétérophiles, un sous-ensemble a été caractérisé pour sa capacité à trier de manière différentielle à partir des cellules parentales L929. Les lignées cellulaires synCAM ont été détachées à l'aide de TrypLE, remises en suspension dans 1 ml de DMEM, comptées puis diluées à 1 × 103 cellules par ml. Les cellules parentales L929 ont été détachées à l'aide de TrypLE, colorées avec CellTrace Far Red conformément aux instructions du fabricant et diluées à 1 × 103 cellules par ml. Deux synCAM et les cellules WT L929 ont été mélangées 1: 1: 1 (80 µl au total) dans un puits à fond rond ULA et imagées après 24 h à un grossissement × 20 en utilisant la microscopie confocale à fluorescence (Phenix). Des images à projection maximale ont ensuite été générées à l'aide du logiciel du fabricant (Harmony). Dans le logiciel, les cellules individuelles ont été segmentées et le centre de l'assemblage a été calculé sur la base de la position moyenne de toutes les cellules. La distance entre les cellules WT (Far Red) L929 et les cellules synCAM (BFP) du centre de l'assemblage précédemment calculé a ensuite été déterminée. La différence entre la distance moyenne des cellules WT et synCAM a ensuite été calculée et représentée sous forme de carte thermique, avec des distances plus grandes correspondant à une exclusion accrue des cellules WT de l'assemblage.

Les synCAM homotypiques ont été conçues pour altérer stériquement les interactions cis ECD de la région de liaison. Des fermetures éclair à leucine antiparallèles, qui devraient favoriser la liaison trans par rapport à la liaison cis, ont été fusionnées à un domaine de liaison fibcon, qui étend le récepteur de la région juxtamembranaire37,38,36. Les efforts pour concevoir des synCAM homotypiques sans le lieur fibcon ont été infructueux. Ces ECD conçus ont été fusionnés à un ICAM-1 TM/ICD.

Des cellules L929 exprimant de manière stable les récepteurs synCAM homophiles et mCherry cytosolique ont été générées. Les lignées cellulaires clonales ont été obtenues par tri unicellulaire. Les lignées cellulaires ont été détachées à l'aide de TrypLE, remises en suspension dans 1 ml de DMEM, comptées puis diluées à 1 × 103 cellules par ml. Les cellules ont été incubées dans une plaque à fond rond ULA à 384 puits (80 cellules, volume total de 80 µl, 37 ° C) pendant 24 h, puis imagées par microscopie confocale à fluorescence (Phenix). Les images à projection maximale ont été générées à l'aide du logiciel du fabricant (Harmony).

Des cellules L929 exprimant WT PCAD et mCherry cytosolique ont été précédemment générées6. Des cellules L929 exprimant la BFP cytosolique avec ou sans expression stable d'une synCAM anti-PCAD (ICAM-1 TM/ICD) ont été mélangées 1:1 avec des cellules L929 exprimant de manière stable la WT PCAD et la mCherry cytosolique dans une plaque à fond rond ULA de 384 puits ( 80 cellules, volume total de 80 µl, 37 ° C) pendant 24 h et imagées par microscopie confocale à fluorescence (Phenix). Les images à projection maximale ont été générées à l'aide du logiciel du fabricant (Harmony). Dans le logiciel Harmony, la surface totale englobée à la fois par les cellules L929 exprimant WT PCAD (mCherry) et les cellules WT ou anti-PCAD (BFP) a été calculée pour chaque image de projection maximale à chaque instant à partir de puits distincts. Le rapport de la surface des cellules BFP aux cellules mCherry a ensuite été calculé et tracé sur 24 h, avec un rapport accru correspondant à l'exclusion des cellules BFP de l'assemblage multicellulaire (Extended Data Fig. 10b). De plus, pour t = 24 h, les cellules ont été segmentées et la position du centre de l'assemblage a été calculée comme la position moyenne des cellules mCherry+ et BFP+. La distance relative des cellules BFP + et mCherry + au centre de l'assemblage a ensuite été calculée (Extended Data Fig. 10c) avec une distance plus grande correspondant à une exclusion accrue des cellules BFP + L929.

Pour les expériences de structuration multicellulaire, les lignées cellulaires L929 ont été détachées à l'aide de TrypLE, remises en suspension dans 1 ml de DMEM, comptées puis diluées à 1 × 103 cellules par ml. Avant dilution, les synCAM Aph4 et IF1 ont été colorées avec CellTrace Far Red et CFSE, respectivement, selon le protocole du fabricant.

Pour générer le motif alterné à deux cellules, des cellules L929 exprimant GFP-ICAM-1 (cellule 1) ont été mélangées avec des cellules L929 exprimant mCherry cytosolique et LaG16-ICAM-1 (anti-GFP) (cellule 2) (1:1 80 µl total). Pour générer le modèle de pontage à trois cellules, des cellules L929 exprimant GFP – ECAD (cellule 1) ont été mélangées avec des cellules exprimant mCherry cytosolique, LaG16 – ECAD et anti-CD19 – ICAM-1 (cellule 2), et des cellules exprimant BFP cytosolique et CD19 –ICAM-1 (cellule 3) (1:2:1 80 µl au total). Pour générer le modèle cyclique à trois cellules, des cellules L929 exprimant GFP-ECAD et anti-MBP-ICAM-1 (cellule 1) ont été mélangées avec des cellules exprimant LaG16-ECAD et mCherry-ICAM-1 (cellule 2) et des cellules exprimant MBP –ICAM-1, LaM4–ICAM-1 et BFP cytosolique (cellule 3) (1:1:1 80 µl au total). Dans tous les cas, les cellules ont été étalées dans des puits à fond rond ULA et imagées après 2 h en utilisant la microscopie confocale (Phenix). Des images de projection maximale de puits distincts ont été générées à l'aide du logiciel du fabricant (Harmony). Pour calculer les tables de probabilité d'interaction, les cellules ont été segmentées dans Harmony pour chaque image de projection maximale. Les contacts cellule-cellule ont été identifiés à partir des positions des cellules segmentées, et la probabilité de chaque interaction a été calculée et représentée sous forme de carte thermique.

Pour former les assemblages cycliques isolés à trois et quatre cellules, des cellules L929 exprimant GFP-ECAD et anti-MBP-ICAM-1 (cellule 1) ; LaG16–ECAD et mCherry–ICAM-1 (cellule 2) ; et MBP – ICAM-1, LaM4 – ICAM-1 et BFP cytosolique (cellule 3) ont été dilués à 4 × 103 cellules par ml et étalés dans un puits à fond plat avec une surface répulsive contre les cellules. Des paires individuelles ont été identifiées et des images à projection maximale ont été générées et exportées.

Des cellules L929 exprimant Wt ECAD et BFP cytosolique, Aph4–ICAM-1 ou IF1–ICAM-1 ont été mélangées les unes aux autres (soit individuellement, soit les trois ensemble) dans des puits à fond rond ULA (1:1 ou 1:1:1, 80 µl au total). Les cellules ont été imagées après 48 h en utilisant la microscopie confocale. Les images de projection maximale ont été générées à partir de puits distincts à l'aide du logiciel du fabricant (Harmony) et ont été classées sur la base du phénotype d'assemblage.

Des fibroblastes dermiques humains adultes (NHDF-Ad) et des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ont été cultivés dans du DMEM contenant 10 % de FBS. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été cultivées dans un milieu de croissance de cellules souches mésenchymateuses (Lonza).

Pour générer des cellules stables exprimant les constructions synCAM, le surnageant viral (15 µl de virus concentré ×20) a été dilué avec 1,5 ml de milieu et étalé directement avec des cellules cultivées à 80 % de confluence (5 × 104 MSC, MEF ou NHDF étalées dans un 12 -bien plat). Puis, 24 h après la transduction, le milieu viral a été remplacé par du milieu de croissance normal et les cellules ont été multipliées dans une boîte à 6 puits. Les MEF ont ensuite été triés pour l'expression des constructions synCAM par FACS.

Sous l'approbation officielle du Comité de recherche sur les gamètes, les embryons et les cellules souches humaines de l'UCSF (GESCR) à FF, nous avons utilisé les lignées de cellules souches embryonnaires humaines WA09 achetées auprès de WiCell dans cette étude. Ces lignées cellulaires et leur échantillon d'origine sont complètement anonymisés et aucun auteur n'a eu accès aux identifiants.

Les hPSC (WA09, WiCell) ont été maintenues dans un milieu E8 sur des plaques à six puits recouvertes de Geltrex. Deux jours avant d'initialiser la différenciation des muscles lisses, les hPSC ont été dissociées avec de l'EDTA et replacées dans une plaque à six puits recouverte de Geltrex. Une fois que les hPSC ont atteint la confluence, le milieu E8 a été aspiré et remplacé par 1 ml par puits d'Essential 6 avec 100 ng ml-1 d'activine A. Le lendemain, le milieu a été aspiré et remplacé par 2 ml par puits de milieu E6 avec 10 ng ml −1 BMP4. Deux jours plus tard, le milieu a été aspiré et remplacé par 2 ml par puits de milieu E6 avec 10 ng ml-1BMP4. Pendant les jours 5 à 9, les cellules ont été maintenues avec du milieu E6 frais + 2 % de FBS tous les deux jours. À partir du jour 10, le milieu a été remplacé trois fois par semaine par Advanced DMEM/F12 + 10 % FBS.

Pour générer des SMC avec une expression stable de synCAM, les SMC ont été cultivées à 80 % de confluence dans une plaque à 96 puits et transduites avec 1 µl de virus concentré 20x. Après 24 h, le milieu a été retiré et remplacé par du milieu frais.

L'épithélium intestinal a été isolé et cultivé comme décrit précédemment57. En bref, les petites cryptes intestinales ont été dissociées du duodénum de souris mâles C57BL/6 âgées de 6 à 12 semaines. Le tissu a été placé dans du PBS glacé avec 15 mM d'EDTA pendant 30 min, puis vortexé vigoureusement en plusieurs fractions pour libérer les cryptes. Le surnageant contenant les cryptes a été filtré sur une maille de 70 μM, puis les cryptes ont été culottées et remises en suspension dans du Matrigel à facteur de croissance réduit et cultivées sous forme d'entéroides 3D avec du milieu ENR (Advanced DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific, 12634-028) avec 1× N2 (Thermo Fisher Scientific, 17502-048), 1× B27 (Thermo Fisher Scientific, 17504-044), 10 mM HEPES (Thermo Fisher Scientific, 15630080), 1× GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, 35050-061) , 1 mM de N-acétylcystéine (Sigma-Aldrich A9165), 100 U ml-1 pénicilline et 100 mg ml-1 streptomycine (Corning, 30-002), additionné de 50 ng ml-1 EGF (Sigma Aldrich, E9644.2MG) , 100 ng ml-1 Noggin (R&D 6057-NG/CF) et milieu conditionné à 5 % de R-spondine). Le milieu a été changé tous les 3 jours et les organoïdes ont été mécaniquement dissociés et passés chaque semaine.

Pour ces expériences, les souris ont été maintenues dans l'animalerie spécifique exempte d'agents pathogènes de l'Université de Californie à San Francisco (UCSF). Tous les entretiens et expériences ont été effectués conformément aux directives établies par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux et le centre de ressources pour animaux de laboratoire. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Laboratory Animal Resource Center de l'UCSF. Les souris ont été logées dans les installations de soins aux animaux UCSF LARC à UCSF Parnassus. Ils ont été hébergés dans une suite individuelle spécifique exempte d'agents pathogènes. Ils ont été hébergés avec jusqu'à cinq souris par cage dans des cages ventilées, avec de la nourriture et de l'eau à volonté sous un cycle lumière-obscurité de 12 h à 12 h et dans des conditions de température et d'humidité contrôlées (20 à 26 ° C et 30 à 70%).

Pour l'expression des constructions synCAM, les organoïdes ont été transduits avec des lentivirus comme décrit précédemment58. Tout d'abord, les entéroïdes 3D ont été dissociés en cellules individuelles à l'aide de TrypLe, qui ont ensuite été cultivées dans du Matrigel à facteur de croissance réduit et du milieu de transduction (milieu NR complété avec 50 % de milieu conditionné Wnt3a, 10 μM de nicotinamide (Sigma-Aldrich, N3376-100G) , 5 μM CHIR (Sigma-Aldrich, SML1046-5MG) et 10 μM Y-27632 (Sigma-Aldrich, Y0503-1MG)) pendant 3 à 5 jours pour enrichir les cellules souches. Les entéroïdes ont ensuite été dissociés, culottés, remis en suspension dans un milieu de transduction contenant 8 μg ml-1 de polybrène (Sigma-Aldrich, H9268-5G) et de lentivirus concentrés, centrifugés à 600 g pendant 1 h à 32 °C, puis incubés à 37 °C pendant 6 h. Les cellules ont ensuite été culottées et remises en suspension dans du Matrigel et cultivées dans un milieu de transduction pendant 3 jours, puis passées au milieu ENR. Après amplification, la sélection antibiotique a été réalisée en ajoutant 1 μg ml-1 de puromycine (Thermo Fisher Scientific, A1113803) au milieu.

GFP-ICAM-1, GFP-tether, anti-GFP-fibcon-ICAM-1 ou anti-GFP-fibcon-tether ont été transduits dans des MSC, des NHDF ou des SMC. Pour ces expériences, un domaine de liaison fibcon a été inclus pour les constructions anti-GFP-ICAM-1 et anti-GFP-tether afin d'améliorer l'expression dans les cellules primaires. Toutes les cellules exprimant la GFP ont été co-transduites avec un plasmide pour l'expression de la BFP cytosolique, et toutes les cellules exprimant l'anti-GFP ont été co-transduites avec une construction exprimant mCherry cytosolique. Puis, 24 h après la transduction, le milieu a été retiré et remplacé par du milieu frais. Après 4 à 7 jours, les MSC, SMC ou NHDF ont été détachées avec du TryplE, remises en suspension dans du milieu et étalées dans une plaque 384 puits. Puis, 24 h après l'ensemencement, les puits ont été imagés par microscopie confocale à fluorescence (Phenix).

Les cellules L929 exprimant de manière stable WT PCAD, mCherry cytosolique et LaG16 – synCAM (ICAM-1, ECAD ou tether control) ont été mélangées 1: 1 avec des cellules L929 exprimant de manière stable WT ECAD, BFP cytosolique et une GFP – synCAM (ICAM-1, ECAD ou tether control) dans une plaque ULA à fond rond (80 cellules au total, 80 µl, 24 h, 37 °C). Avant mélange, les lignées cellulaires L929 ont été détachées à l'aide de TrypLE, remises en suspension dans 1 ml de DMEM, comptées puis diluées à 1 × 103 cellules par ml. Les assemblages ont été imagés à l'aide de la microscopie confocale à fluorescence (Phenix, grossissement ×20), et des images de projection maximale de puits distincts ont été générées à l'aide du logiciel du fabricant et sont présentées.

Pour modifier l'assemblage entre les cellules L929 exprimant WT NCAD et les cellules L929 exprimant WT PCAD, l'expérience a été réalisée exactement comme décrit ci-dessus avec des cellules L929 exprimant WT NCAD et GFP cytosolique à la place des cellules WT ECAD.

Une couche adhérente de cellules MDCK exprimant BFP cytosolique et GFP – Tether, GFP – ICAM-1 ou GFP – ECAD a été formée dans les puits d'une plaque à 384 puits (16 000 cellules plaquées par puits). Après 48 h, des cellules L929 exprimant WT PCAD, mCherry cytosolique et LaG16 – ICAM-1, LaG16 – tether, LaG16 – ECAD ou aucun récepteur supplémentaire ont été ajoutées (24 000 cellules par puits). L'interaction entre les deux couches a été imagée par microscopie confocale à fluorescence (Phenix) pendant 24 h. Les images agrandies des assemblages ont été formées en assemblant neuf champs de vision adjacents après avoir exporté les images à partir du logiciel du fabricant. La rondeur et la surface de l'assemblage mCherry+ ont été quantifiées pour chaque champ de l'expérience dans le logiciel du fabricant (Harmony).

Des cultures d'entéroïdes monocouches ont été établies comme décrit précédemment59. Les entéroïdes 3D ont été dissociés en cellules individuelles à l'aide de TrypLE, lavés dans du PBS et colorés à l'aide de CellTrace. Un total de 150 000 cellules exprimant GFP-ICAM-1 ou GFP-Tether ont été étalées sur une pate de 384 puits pré-enduite de Matrigel à facteur de croissance réduit à 5% dans 40 μl de milieu ENR additionné de 3 μM CHIR et 10 μM Y-27632 . Après 4 h, 60 µl supplémentaires de milieu ENR ont été ajoutés dans chaque puits. Puis, 24 h après le placage, les monocouches entéroïdes, les cellules fibroblastiques embryonnaires de souris (MEF) exprimant l'anti-GFP-fibcon-tether ou l'anti-GFP-fibcon-ICAM-1 et le mCherry cytosolique ont été ajoutés (16 000 cellules). Après 24 h, les puits ont été imagés par microscopie confocale à fluorescence (Phenix). Les images à projection maximale et les images 3D ont été exportées à partir du logiciel du fabricant (Harmony).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Des données expérimentales étayant les conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et les informations supplémentaires. Toutes les bases de données utilisées dans cette étude sont accessibles au public. Pour identifier les séquences de protéines et l'architecture de domaine, Universal Protein Resource (https://www.uniprot.org/) a été utilisé. Pour l'identification des motifs linéaires dans les CIM CAM, la ressource Eukaryotic Linear Motif (ELM) (http://elm.eu.org/) a été utilisée. Des répliques de microscopie supplémentaires sont disponibles sur Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21647546.v1). Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions D. Mullins, Z. Gartner, V. Weaver, M. Kutys et les membres du laboratoire Lim et Cell Design Institute pour les discussions, l'assistance et les conseils. Ce travail a été soutenu par un NSF Center for cellular construction grant (DBI-1548297), le NIH NCI (U01CA265697) et l'UCSF Cell Design Institute. AJS est un Damon Runyon Fellow soutenu par la Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG, 2355-19) et est un Hartz Cell Design Fellow. ARH a été soutenu par une subvention à la découverte du CRSNG (RGPIN-2022-04933). JG a été soutenu par l'Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux, via le numéro de subvention UCSF 2R25NS070680-11.

Andrew R. Harris

Adresse actuelle : Département de génie mécanique et aérospatial, Université Carleton, Ottawa, Ontario, Canada

Wesley L. McKeithan

Adresse actuelle : Maze Therapeutics, San Francisco, Californie, États-Unis

UCSF Cell Design Institute, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

Adam J. Stevens, Josiah Gerdts, Ki H. Kim, Wesley L. McKeithan et Wendell A. Lim

Département de pharmacologie cellulaire et moléculaire, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

Adam J. Stevens, Josiah Gerdts, Ki H. Kim, Jonathan T. Ramirez, Wesley L. McKeithan, Faranak Fattahi et Wendell A. Lim

Center for Cellular Construction, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

Adam J. Stevens, Andrew R. Harris, Josiah Gerdts, Ki H. Kim, Wesley L. McKeithan, Daniel A. Fletcher et Wendell A. Lim

Département de bioingénierie, Université de Californie, Berkeley, Californie, États-Unis

Andrew R. Harris et Daniel A. Fletcher

Département de neurologie, Weill Institute for Neuroscience, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

Josiah Gerdts

Programme en biologie craniofaciale, Université de Californie, San Francisco, CA, États-Unis

Coralie Trentesaux & Ophir D. Klein

Département des sciences orofaciales, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

Coralie Trentesaux & Ophir D. Klein

Centre Eli et Edythe Broad de médecine régénérative et de recherche sur les cellules souches, Université de Californie, San Francisco, Californie, États-Unis

Jonathan T. Ramirez & Faranak Fattahi

Département de pédiatrie, Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, Californie, États-Unis

Ophir D.Klein

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, Californie, États-Unis

Daniel A. Fletcher

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Recherche conçue par AJS, ARH, CT, FF, ODK, DAF et WAL. AJS, JG, KHK et WLM ont cloné des plasmides et généré des lignées cellulaires. AJS a réalisé des expériences d'adhésion cellule-cellule. ARH a réalisé des expériences d'adhérence par propagation cellulaire. AJSCT, JTR et KHK ont réalisé des expériences d'adhésion dans des cellules primaires et dérivées de cellules iPS. AJS et ARH ont analysé les données. AJS, ARH, DAF et WAL ont rédigé l'article.

Correspondance à Wendell A. Lim.

WAL est conseiller pour Allogene et SciFi Foods, et détient des actions dans Gilead et Intellia. Une demande de brevet a été déposée par l'Université de Californie à San Francisco concernant les molécules d'adhérence modifiées rapportées dans ce travail avec WAL et AJS répertoriés comme inventeurs (PCT/US2021/057601). Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Matthias Lutolf et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

( a ) Analyse FACS de l'expression de synCAM GFP (à gauche) et αGFP (à droite) dans des cellules de fibroblastes L929 après le tri cellulaire. L'expression de surface de chaque synCAM est mesurée à l'aide d'un anticorps anti-étiquette FLAG marqué. Le domaine CAM TM et ICD pour chaque construction est indiqué (tether = contrôle sans ICD, DLL1 = Delta-like Protein 1, JAM-B = Junction Adhesion Molecule B, NCAM-1 = Neural Cell Adhesion molecule 1, MUC-4 = Mucine 4, ICAM-1 = Molécule d'adhésion intercellulaire 1, Ecad = E-cadhérine, Intβ1 = intégrine bêta 1, Intβ2 = intégrine bêta 2). L'analyse montre que les niveaux d'expression de surface des constructions d'attache et de synCAM alternatives sont bien appariés. ( b ) Répétitions supplémentaires de l'analyse de l'interface d'adhérence cellule-cellule synCAM. Projection maximale d'images de microscopie confocale 20x d'interfaces synCAM par paires (t = 3 h) : la cellule exprimant la GFP (bleu) est liée à une cellule exprimant la αGFP (orange). Le canal GFP des interfaces est montré, mettant en évidence les différences d'enrichissement en récepteurs. Quatre exemples supplémentaires sur vingt sont présentés ici. ( c ) Analyse FACS de l'expression de αGFP synCAM dans des cellules de fibroblastes L929 exprimant mCherry cytosolique (à gauche) ou BFP (à droite) après le tri cellulaire. Le domaine CAM TM et ICD pour chaque construction est ICAM-1, et l'ECD du nanocorps de lama (LaG) se liant à la GFP pour chaque construction est indiqué. Cette analyse montre que cette série de synCAMs d'affinité alternative sont exprimées à des niveaux comparables. ( d ) Projection maximale d'images de microscopie confocale 20X d'interfaces synCAM par paires (t = 3 h): la cellule exprimant la GFP (bleue) est liée à une cellule exprimant la αGFP avec la liaison indiquée Kd (orange).

( a ) Analyse FACS de l'expression de αGFP synCAM dans des cellules de fibroblastes L929 exprimant mCherry cytosolique après le tri cellulaire. Le domaine CAM TM et ICD pour chaque construction est NCAM-1 ou Intβ1, et l'ECD du nanocorps de lama (LaG) se liant à la GFP pour chaque construction est indiqué. Cette analyse montre que cette série de synCAMs d'affinité alternative sont exprimées à des niveaux comparables. (b) Projection maximale d'images de microscopie confocale 20X d'interfaces synCAM par paires (t = 3 h, barre d'échelle = 10 µm). En haut : la cellule exprimant la GFP (bleue) est liée à une cellule exprimant la αGFP (orange). Le domaine CAM TM et ICD pour chaque paire est Intβ1. En bas : canal GFP des interfaces ci-dessus mettant en évidence les différences d'enrichissement en récepteurs à l'interface. (c) Projection maximale d'images de microscopie confocale 20X d'interfaces synCAM par paires (t = 3 h, barre d'échelle = 10 µm). En haut : la cellule exprimant la GFP (bleue) est liée à une cellule exprimant la αGFP (orange). Le domaine CAM TM et ICD pour chaque paire est NCAM-1. En bas : canal GFP des interfaces ci-dessus mettant en évidence les différences d'enrichissement en récepteurs à l'interface. ( d ) Parcelles d'angles de contact mesurés à partir des interfaces indiquées en b et c par rapport à l'affinité de nanocorps LaG correspondante (les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes de n = 10 paires, erreur = 95 % IC). Les angles de contact pour Intβ1 (bleu) sont représentés par rapport à NCAM-1 (rouge) et au contrôle d'attache de la Fig. 1f (noir). ( e ) Parcelles d'enrichissement en GFP mesurés à partir des interfaces indiquées en b et c par rapport à l'affinité de nanocorps LaG correspondante (les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes de n = 10 paires, erreur = 95 % IC). L'enrichissement en GFP pour NCAM-1 (rouge) est présenté par rapport à Intβ1 (bleu) et au contrôle d'attache de la Fig. 1f (noir).

Données source

( a ) Représentation en dessin animé du test de compétition de tri différentiel (à gauche) et quantification de la distribution radiale représentée sous forme de carte thermique (à droite). Cette expérience représente une autre façon de mesurer les préférences d'adhésion / la force des diverses interactions cellule-cellule pilotées par synCAM qui diffère de la mesure de l'angle de contact illustrée à la Fig. 1f. Ici, nous mélangeons des cellules GFP L929 de surface (cellules appâts) avec deux cellules L929 étiquetées différemment en compétition, chacune avec une synCAM αGFP différente. Une adhérence plus forte du synCAM est évaluée via le degré relatif de co-tri des cellules compétitrices au noyau en conjonction avec les cellules appâts. Nous calculons la distribution radiale des cellules concurrentes (rouge/bleu) à partir du centroïde du sphéroïde. (b) Images de projection maximales représentatives du test de compétition de tri cellulaire entre les cellules L929 exprimant αGFP-ICAM-1 avec le nanocorps ECD LaG indiqué (mCherry ou BFP) mélangé avec des cellules L929 exprimant GFP-ICAM-1 (t = 24 h, barre d'échelle = 50 µm). ( c ) Quantification du test de compétition de tri cellulaire à partir de b ( n = 4). ( d ) Images de projection maximales représentatives du test de compétition de tri cellulaire entre les cellules L929 exprimant αGFP-ICAM-1 et les cellules cytosoliques et L929 exprimant αGFP-Tether mélangées à des cellules L929 exprimant GFP-ICAM-1 (barre d'échelle = 20 µm, t = 24 h). ( e ) Quantification du test de compétition de tri cellulaire à partir de d ( n = 4).

Données source

( a ) Analyse FACS de l'expression de GFP synCAM et αGFP synCAM dans des cellules de fibroblastes L929 après tri cellulaire avec un ICAM-1 ou Tether ICD. Pour les constructions GFP, l'expression est montrée à la fois pour le signal GFP total dans la cellule (axe Y) et les cellules colorées avec un anticorps αFlag APC 647 (axe x). (b) Projection maximale d'images de microscopie confocale 20X d'interfaces synCAM par paires (t = 3 h, barre d'échelle = 10 µm) de différents niveaux d'expression du panneau a : la cellule exprimant la GFP (bleue) est liée à une cellule exprimant la αGFP (orange ). Le domaine CAM TM et ICD pour chaque paire est ICAM-1 ou Tether. ( c ) Diagrammes en boîte et moustaches (boîte = 25e au 75e centile, moustaches = min à max, centre = médiane) des angles de contact mesurés à partir des interfaces indiquées en b (n = 10 paires).

Données source

( a ) Exemple d'images de microscopie d'essais d'étalement cellulaire de la Fig. 2, montrant les phénotypes de toutes les espèces de synCAM (barre d'échelle = 10 µm). Des images représentatives sont présentées de répliques indépendantes de Tether n = 10, ICAM-1 n = 20, JAM-B n = 20, MUC-4 n = 15, NCAM-1 n = 20, Intβ1 n = 20, Intβ2 n = 20 Les SynCAM sont exprimées dans des fibroblastes L929 et plaquées sur une surface en verre revêtue de GFP. L'empreinte cellulaire détectée par le colorant membranaire est indiquée en contour bleu ; actine colorée par la phalloïdine et représentée en blanc. (b) Caricature illustrant le test de propagation cellulaire. Les cellules L929 exprimant une synCAM αGFP sont étalées sur une surface revêtue de GFP et surveillées au fil du temps. ( c ) Images représentées à partir d'un test d'étalement cellulaire de cellules L929 exprimant les synCAM indiquées. Des tranches individuelles d'images confocales sont affichées. Barre d'échelle = 10 µm. ( d ) Courbes de progression de la zone de contact d'étalement cellulaire représentatives des cellules L929 exprimant les synCAM indiquées. Erreur = SEM. (e) Constantes d'étalement calculées pour les cellules L929 exprimant les synCAM indiquées (où n est le nombre de cellules uniques analysées, Tether n = 24, Ecad n = 17, JAM-B n = 23, ICAM-1 n = 16, Intβ1 n = 16, Intβ2 n = 18, NCAM-1 n = 14, MUC-4 n = 12. La ligne indiquée représente la valeur médiane).

Données source

( a ) Exemple d'images de microscopie de fibroblastes L929 exprimant αGFP JAM-B, ICAM-1 ou Tether s'étalant sur une surface revêtue de GFP et colorées avec de la phalloïdine (barre d'échelle = 10 µm). L'étalement est montré en présence de l'inhibiteur indiqué de la régulation de l'actine. Un minimum de 10 régions d'intérêt ont été imagés sur deux jours distincts. (b) Images confocales de projection maximale (barre d'échelle = 10 µm) et angles de contact calculés des interfaces synCAM contenant l'ICAM-1 ICD avec des mutations dans les domaines de liaison ERM (BD) (boîte = 25e au 75e centile, moustaches = min à max, centre = médiane, n = 20 paires)60. ( c ) Images confocales de projection maximale (barre d'échelle = 10 µm) et angles de contact calculés des interfaces synCAM contenant le ICD Intβ1 avec des mutations dans les deux motifs de domaine de liaison talin "NPxY" (boîte = 25e au 75e centile, moustaches = min à max, centre = médiane, n = 20 paires)61. ( d ) Images confocales de projection maximale (barre d'échelle = 10 µm) et angles de contact calculés des interfaces synCAM contenant le ICD Intβ2 avec des mutations dans les deux motifs de domaine de liaison talin "NPxF" (boîte = 25e au 75e centile, moustaches = min à max, centre = médiane, n = 20 paires)62. (e) Images confocales de projection maximale (barre d'échelle = 10 µm) et angles de contact calculés des interfaces synCAM contenant le CIM Ecad avec des mutations dans le domaine de liaison de la β-caténine (boîte = 25e au 75e centile, moustaches = min à max, centre = médiane, n = 20 paires)63. ( f ) Images confocales de projection maximale (barre d'échelle = 10 µm) et calcul des angles de contact et de l'enrichissement GFP des interfaces synCAM contenant le MUC-4 ICD avec des mutations dans les sites de phosphorylation Ser et Tyr (boîte = 25e au 75e centile, moustaches = min à max, centre = médiane, n = 20 paires). ( g ) Images confocales de projection maximale (barre d'échelle = 10 µm) et angles de contact calculés et enrichissement GFP des interfaces synCAM contenant le JAM ICD avec des mutations dans le domaine de liaison PDZ (boîte = 25e au 75e centile, moustaches = min à max, centre = médiane, n = 20 paires). ( h ) Images confocales de projection maximale (barre d'échelle = 10 μm), angles de contact calculés et enrichissement GFP des interfaces synCAM contenant le NCAM-1 ICD avec des mutations dans le site de palmitoylation de Cys (boîte = 25e au 75e centile, moustaches = min à max, centre = médiane, n = 20 paires)64.

Données source

(a) Projection maximale d'images de microscopie confocale 20x d'interfaces synCAM par paires (barre d'échelle = 10 µm, t = 3 h) : la cellule exprimant la GFP (bleue) est liée à une cellule exprimant la αGFP (orange) contenant le CAM ICD indiqué. Des images représentatives sont présentées de 10 paires de cellules indépendantes. ( b ) Canal GFP de paires de cellules illustré en a.

( a ) Dessin animé illustrant un test de tri différentiel utilisé pour déterminer l'orthogonalité des paires synCAM ECD. Les paires de SynCAM sont mélangées avec des cellules L929 parentales et imagées après 24 h. Le tri des cellules parentales ne devrait se produire que si les ECD synCAM apparentés sont correctement appariés et capables de se lier. ( b ) Images de projection maximales représentatives du test de tri différentiel pour un sous-ensemble de synCAM avec ECD orthogonaux (barre d'échelle = 20 µm). Le tri parental des cellules L929 n'a été observé que dans le cas d'ECD appariés. (c) Quantification du tri à partir de b (n = 6). La différence de distance moyenne du centre de la sphère entre les cellules parentales L929 et les cellules BFP + a été calculée et est représentée sous forme de carte thermique. L'exclusion des cellules parentales est observée dans le cas de paires synCAM appariées. ( d ) Images de projection maximales représentatives de la conception synCAM contenant plusieurs épitopes dans un seul ECD (barre d'échelle = 20 µm). L'ECD HA-CD19 présente un tri différentiel pour les synCAM αCD19 ou αHA uniquement. Ainsi, nous pouvons générer des synCAMs OR-gate capables de s'apparier avec plusieurs partenaires d'adhésion. (e) Quantification du tri à partir de d (n = 6). La différence de distance moyenne du centre de la sphère entre les cellules parentales L929 et les cellules BFP + a été calculée et est représentée sous forme de carte thermique. L'exclusion des cellules parentales est observée dans le cas de paires synCAM appariées.

Données source

Projection maximale d'images de microscopie confocale 20X de tri différentiel entre les cellules L929 exprimant WT Ecad ou les synCAMs à liaison homophile indiquées (barre d'échelle = 50 µm, t = 48 h). Des images représentatives, des classifications d'assemblage et des distributions sont présentées pour Ecad-IF1 (a), Ecad-Aph4 (b), IF1-Aph4 (c) et Ecad-IF1-Aph4 (d).

( a ) Images de projection maximales de l'essai de tri dans lequel les cellules L929 exprimant WT Pcad (orange) sont mélangées avec des cellules L929 parentales (à gauche) ou synCAM (à droite) (bleu, t = 0, 24 h, barre d'échelle = 50 µm) . ( b ) Quantification de la zone relative entre le contrôle négatif BFP ou les cellules αPcad synCAM et mCherry (Pcad) L929 au cours de l'assemblage de 24 h (n = 4 échantillons biologiquement indépendants, erreur = SEM). Une plus grande différence de surface est compatible avec une sphère Pcad plus compacte et l'exclusion des cellules BFP+. ( c ) Quantification de la distance relative par cellule (BFP-mCherry) du centre de la sphère après l'assemblage (t = 24 h, n = 4 échantillons biologiquement indépendants, ligne = moyenne). Les cellules WT BFP présentent une plus grande différence de distance, ce qui est cohérent avec leur exclusion de la sphère Pcad, tandis que les synCAM αPCAD s'intercalent.

Données source

Projection maximale d'images de microscopie confocale 20x de synCAMs αGFP et GFP (avec ICAM-1 ICD) ou attache correspondante (sans ICD) exprimées en MSC (a, barre d'échelle = 10 µm) fibroblastes dermiques primaires (b, barre d'échelle = 20 µm) ou SMC dérivés iPSC (c, barre d'échelle = 20 µm). Les cellules αGFP ont également été marquées avec mCherry; Les cellules GFP ont également été marquées au BFP. Des images représentatives sont présentées de trois répétitions indépendantes. Dans les deux types de cellules, l'attache GFP est diffusée de manière diffuse dans toute la cellule. En revanche, la GFP-synCAM est fortement enrichie en interfaces cellule-cellule athétérotypiques (flèches blanches). Lorsque les cellules exprimant GFP-synCAMs sont étalées sans leurs cellules partenaires, la GFP est distribuée de manière diffuse dans toute la cellule.

(a) dessin animé illustrant la modulation du tri WT Ncad (vert) et WT Pcad (orange) par l'introduction de synCAM. (b) Projections maximales d'images de microscopie confocale 20X de cellules WT Pcad et WT Ncad L929 avec expression des synCAM hétérophiles indiquées (barre d'échelle = 20 µm, t = 24 h). La GFP-synCAM est exprimée dans la cellule L929 exprimant Ncad et la synCAM αGFP dans la cellule L929 exprimant Pcad. Des images représentatives sont présentées de trois répétitions indépendantes. Ces données montrent que les synCAM peuvent piloter l'intégration entre le tri différentiel des cellules Pcad et Ncad, tout comme elles le peuvent entre les cellules Pcad et Ecad (Fig. 5a). ( c ) Quantification de la rondeur (à gauche) et de la surface totale (à droite) des cellules L929 à partir de projections maximales d'images confocales 20x sur la figure 5b (les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes de n = 18 champs uniques analysés dans deux puits indépendants, erreur = SD). (d) Vues 3D (en haut) et en projection maximale (en bas) d'assemblages multicellulaires entre une monocouche épithéliale intestinale de souris (vert) et des cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) (orange) avec une attache GFP-αGFP (à gauche) ou ICAM synthétique -1 (droite) interaction d'adhésion hétérophile. Des images représentatives sont présentées de deux répétitions indépendantes.

Données source

Interfaces cellule-cellule SynCAM. Des mesures d'angle de contact et d'enrichissement GFP sont fournies. Erreur = IC à 95 %.

Séquences de constructions protéiques utilisées dans cette étude. L'étiquette d'épitope est surlignée en rouge, la région de liaison à l'ECD est indiquée en bleu et la région TM et l'ICD en gras.

Domaines SLiM des ICD CAM utilisés dans les synCAM. Les SLiM ont été identifiés à partir de la base de données ELM et des sources de la littérature.

Auto-assemblage de cellules avec des paires synCAM orthogonales. Des ECD alternatifs avec ICAM-1 ICD sont présentés (liés à la Fig. 4a).

Réseau d'interaction synCAM à trois cellules. Les réseaux d'interaction synCAM à trois cellules pilotent l'assemblage des cellules (lié à la Fig. 4b).

Intercalation de SynCAM dans les assemblages natifs. Anti-PCAD synCAM (ICAM-1 ICD) entraîne l'intercalation cellulaire dans le cluster PCAD (lié à la Fig. 4e).

Remodelage de l'organisation tissulaire. Les SynCAM peuvent entraîner le couplage et le remodelage complexe des tissus épithéliaux et sphéroïdes (liés à la Fig. 5b).

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui autorise l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Stevens, AJ, Harris, AR, Gerdts, J. et al. Programmation d'assemblages multicellulaires avec des molécules synthétiques d'adhésion cellulaire. Nature 614, 144-152 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05622-z

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Reçu : 28 octobre 2021

Accepté : 02 décembre 2022

Publié: 12 décembre 2022

Date d'émission : 02 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-05622-z

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