La combinaison de Lactobacillus fermentum NS9 et d'extrait d'aronia anthocyanidine soulage l'iodate de sodium

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8380 (2023) Citer cet article

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Il est important d'explorer les approches efficaces pour prévenir la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) sèche. Dans cette étude, des amplitudes d'ondes d'électrorétinogrammes plein champ significativement diminuées et des structures de rétine désordonnées ont été détectées dans les rétines de rat du modèle de DMLA sèche induite par l'iodate de sodium. Six amplitudes d'ondes a et b et les activités antioxydantes ont été significativement augmentées, et l'épaisseur de la couche nucléaire externe a été significativement améliorée dans les rétines de rats traitées avec la combinaison de Lactobacillus fermentum NS9 (LF) et d'extrait d'aronia anthocyanidine (AAE) par rapport au modèle. Les effets étaient bien meilleurs que le traitement avec AAE seul. L'analyse protéomique a montré que les expressions des cristallines α, β et γ étaient augmentées de 3 à 8 fois dans l'AAE traité seul et de 6 à 11 fois dans le traitement AAE + LF par rapport au modèle, ce qui a été confirmé par immuno- analyse par transfert. L'analyse de la composition microbienne intestinale a indiqué qu'une plus grande abondance du genre Parasutterella et de l'espèce P. excrementihominis a été trouvée dans le traitement AAE + LF par rapport aux autres groupes. Les résultats ont indiqué que le traitement combiné AAE + LF est un moyen potentiel de prévenir la dégénérescence de la rétine qui est significativement meilleur que l'AAE traité seul.

La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est connue comme une maladie oculaire grave due à des dommages structurels dégénératifs et à une perte de fonction de la rétine qui entraîne une perte progressive de la vision centrale et la cécité1,2. La DMLA sèche représente environ 90 % du nombre total de patients atteints de DMLA1. Actuellement, le manque de traitements efficaces pour gérer la DMLA sèche est un problème majeur. Il est nécessaire d'explorer les options thérapeutiques possibles pour la DMLA sèche.

En tant que trouble lié à l'âge, la DMLA est souvent associée à la maladie d'Alzheimer (MA), dans laquelle les anomalies visuelles sont prédominantes et sont censées se développer avant le déclin cognitif. Les deux maladies partagent plusieurs caractéristiques, notamment des dépôts de β-amyloïde (Aβ), une inflammation chronique et un stress oxydatif3. Nous avons démontré que l'ingestion de la souche Lactobacillus NS réduisait l'anxiété et améliorait la fonction cognitive chez les rats atteints d'hyperammoniémie4. L. helveticus NS8 et L. fermentum NS9 ont montré des effets spécifiques à la souche pour la régulation du peptidome cérébral5. L. fermentum NS9 a également normalisé la composition du microbiote intestinal et atténué l'altération de la mémoire induite par l'ampicilline6.

Bien que le mécanisme exact de la DMLA sèche reste inconnu, on pense que les dommages induits par le stress oxydatif des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (RPE) et des photorécepteurs sont fortement impliqués dans la pathogenèse de la DMLA7. Une étude récente a montré que L. fermentum soulageait le stress oxydatif et l'inflammation dans le modèle de vieillissement induit par le D-galactose8. De plus en plus d'études indiquent également que le microbiote intestinal joue un rôle important dans la santé oculaire et que l'axe intestin-rétine est impliqué dans les troubles maculaires liés à l'âge9. La dysbiose microbienne pourrait modifier la perméabilité de la barrière hémato-rétinienne et être liée à la dégénérescence rétinienne10. Le microbiote intestinal pourrait également agir comme facteur régulateur de l'inflammation et des réponses immunitaires11. Il a été rapporté que L. paracasei KW3110 supprimait l'inflammation chronique liée à l'âge et la perte de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) en modulant la composition du microbiote intestinal et la fonction du système immunitaire12.

Dans une étude précédente, nous avons découvert que l'aronia anthocyanidine avait des effets protecteurs sur la rétine du rat, avec une expression accrue significative des protéines cristallines, tandis que les effets sur l'électrorétinogramme (ERG) et la structure de la rétine du rat étaient modestes13. Il existe des interactions mutuelles entre les polyphénols et le microbiote intestinal, et une efficacité accrue a été observée lorsque les probiotiques sont associés aux prébiotiques14,15.

L'iodate de sodium (NaIO3) est un agent oxydant et peut induire des dommages sélectifs à l'EPR. Le modèle murin NaIO3 a été largement utilisé pour étudier la DMLA sèche car il entraîne une dégénérescence rétinienne reproductible et inégale16,17,18. Dans cette étude, nous avons étudié les effets et les mécanismes possibles de l'extrait d'aronia anthocyanidine (AAE) avec L. fermentum NS9 (LF) sur la rétine de rat dans le modèle de DMLA sèche induite par NaIO3, en comparaison avec le traitement AAE seul.

L'ERG est une mesure courante et sensible pour évaluer la fonction rétinienne19. Dans le groupe modèle, les amplitudes de l'ERG ont été significativement diminuées par rapport au groupe témoin, y compris les diminutions de l'onde b de l'ERG scotopique 0,01 de 88,01 %, des ondes a et b de l'ERG scotopique 3.0 de 71,75 % et 90,34 %, l'amplitude totale de Scotopic 3.0 oscillatoire (3 ops) de 80,10 %, l'onde b de Photopic 3.0 ERG de 61,51 % et l'amplitude de l'onde P1 du scintillement Photopic 3.0 de 76,01 % respectivement (Figs. 1 et 2A – F), ce qui indique une fonction d'aggravation globale de la rétine de rat après traitement au NaIO3. Par rapport au groupe modèle, le traitement AAE a significativement amélioré les amplitudes des ondes b du scintillement Scotopic 0.01 ERG, Photopic 3.0 ERG et Photopic 3.0 de 150,96 %, 99,36 % et 58,90 %, respectivement (Figs. 1 et 2A, E, F) , ce qui coïncidait avec notre précédente découverte13. Les effets protecteurs étaient plus significatifs dans le traitement de l'AAE avec la FL. Les amplitudes des ondes a et b des ERG pour les six mesures différentes ont été significativement augmentées de 233,35 %, 149,90 %, 201,43 %, 189,55 %, 130,42 % et 142,79 %, respectivement, par rapport au modèle (Figs. 1 et 2A–F) . Les ondes a et b de l'ERG Scotopic 3.0 ont encore augmenté de 112,07 % et 50,28 %, l'amplitude totale de l'oscillation Scotopic 3.0 de 66,73 % et l'amplitude de l'onde P1 du scintillement Photopic 3.0 de 52,80 % par rapport au groupe AAE (Figs. 1 et 2B–D,F).

Spectres enregistrés de l'ERG plein champ des rétines de rat dans différents traitements. Scotopic 0,01 ERG, Scotopic 3,0 ERG, Scotopic 3,0 potentiels oscillatoires, Photopic 3,0 ERG et Photopic 3,0 scintillement de la rétine de rat ont été enregistrés selon la norme ISCEV (International Society of Clinical Electrophysilological Vision). Contrôle : contrôle sans traitement ; Modèle : modèle de dommages par injection de NaIO3 dans la veine caudale de 30 mg/kg de poids corporel ; AAE : aronia anthocyanidine (60 mg/kg de poids corporel) traitement du modèle de dommages ; AAE + LF : traitement avec 60 mg/kg de poids corporel d'anthocyanidine d'aronia et 108 UFC/ml de L. fermentum NS9 du modèle de dommages.

Amplitudes ERG moyennes des rétines de rat dans différents traitements. (A) onde b de Scotopic 0,01 ERG ; (B, C) ondes a et b de Scotopic 3.0 ERG ; (D) amplitude totale de Scotopic 3.0 oscillatoire (3 ops); (E) onde b de Photopic 3.0 ERG ; (F) Amplitude de l'onde P1 du scintillement Photopic 3.0. Les données présentées sont la moyenne ± écart type (n = 10). *p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Tukey).

La fonction protectrice des traitements a également été démontrée dans l'analyse histologique de la structure rétinienne. La rétine dans le modèle de dommages induits par NaIO3 a montré une structure désordonnée et une réduction des couches cellulaires avec des couches nucléaires externes et internes désordonnées (ONL et INL). Les rétines du groupe AAE ont montré une amélioration de sa structure et de ses couches cellulaires. L'amélioration était encore plus significative dans le groupe AAE + LF, l'alignement de leur noyau était relativement en ordre (Fig. 3A). L'épaisseur moyenne de l'ONL a été significativement réduite de 49,89 % dans le modèle par rapport au contrôle. Par rapport au modèle, l'épaisseur de l'ONL a été significativement augmentée de 39,53 % et 78,67 % respectivement en AAE et AAE + LF (Fig. 3B). L'épaisseur moyenne de l'ONL a augmenté de 28,06 % dans les groupes AAE + LF par rapport au groupe AAE (Fig. 3B).

Effets protecteurs de l'AAE seul et de l'AAE + LF sur la structure rétinienne du rat. (A) Images de la section de rétine de rat colorée H & E, prises à un grossissement de 200 ×; (B) Épaisseur de la couche nucléaire externe des rétines, les données présentées sont la moyenne ± les écarts-types (n = 4). *p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Tukey). Couche nucléaire externe ONL, couche nucléaire interne INL. La barre équivaut à 50 µm.

Comme le montre la figure 4, les activités des enzymes antioxydantes superoxyde dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathion peroxydase (GPx) ont été réduites de 11,52 %, 11,50 % et 8,79 %, respectivement, et le niveau de malondialdéhyde (MDA) a été augmenté de 99,26 % dans le groupe modèle par rapport à ceux du groupe témoin, ce qui indique une détérioration du statut antioxydant chez les rats endommagés. Une augmentation limitée de l'activité GPx et une diminution du niveau de MDA ont été observées chez les rats traités à l'AAE (Fig. 4C, D). Le traitement AAE + LF a montré une amélioration significative de la capacité antioxydante de la rétine. Les activités enzymatiques de SOD, CAT et GPx ont été augmentées de 14,37 %, 30,53 % et 4,72 %, respectivement, et le niveau de MDA a été réduit de 55,57 % dans le traitement AAE + LF par rapport au modèle (Fig. 4). Les activités SOD, CAT ont été augmentées de 14,67 % et 30,00 %, et le niveau de MDA a été diminué de 29,88 % dans le traitement AAE + LF par rapport au traitement AAE (Fig. 4). Les résultats suggèrent que le traitement de l'AAE + LF a augmenté de manière significative la capacité antioxydante en régulant à la hausse les activités des enzymes antioxydantes et en diminuant la production de MDA dans la rétine endommagée du rat.

Capacité antioxydante des rétines de rat. (A–C) activités SOD, CAT et GPx, respectivement ; (D) Contenu MDA. Les données présentées sont la moyenne ± les écarts-types (n = 8). *p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Tukey). SOD superoxyde dismutase, CAT catalase, GPx glutathion peroxydase, MDA malondialdéhyde.

Une étude précédente a indiqué que le traitement avec l'extrait de fruit d'aronia entraînait une régulation positive des protéines cristallines dans la condition de stress13. Dans cette étude, 14 protéines cristallines, dont la chaîne α-cristalline A (αA), la chaîne α-cristalline B (αB), la β-cristalline A3 (βA3), la β-cristalline A4 (βA4), la β-cristalline B1 (βB1) ,β-cristalline B2 (βB2), β-cristalline B3 (βB3) et γ-cristalline AE (γA-E), γ-cristalline S (γS) et γ-cristalline N (γN) ont été trouvées dans des rétines de rat par spectrométrie de masse . Comme le montre la figure 5A, les pourcentages relatifs des 14 protéines mentionnées ci-dessus dans les protéines cristallines totales des rétines de rats témoins étaient de 37,00 %, 9,42 %, 7,64 %, 4,29 %, 3,61 %, 22,01 %, 4,25 %, 0,33 %, 2,20 %, 1,17 %, 1,01 %, 0,01 %, 6,91 % et 0,15 %, respectivement.

Expression des protéines cristallines et de la caspase 3 dans la rétine de rat. (A) Pourcentage d'expression relatif de différentes cristallines chez le rat témoin (la quantité moyenne de chaque protéine exprimée dans le groupe NOR a été fixée à 1 ou 100 %) ; (B) Expression de la chaîne A α-cristalline (αA), chaîne B α-cristalline (αB), β-cristalline A3 (βA3), β-cristalline A4 (βA4), β-cristalline B1 (βB1), β-cristalline B2 (βB2), β-cristallin B3 (βB3) et γ-cristallin S (γS) dans différents traitements, déterminés par spectrométrie de masse; (C) Immunoblot de αA et γS dans des échantillons de rétine. Histone H2B détectée comme référence interne pour montrer une expression protéique de base dans chaque échantillon ; (D) Expression de la caspase 3 dans différents traitements. Les données présentées sont la moyenne ± les écarts-types (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Tukey).

Les expressions des 8 premières cristallines, y compris αA, αB, βA3, βA4, βB1, βB2, βB3 et γS ont été comparées entre différents traitements de rats. L'expression des 8 protéines avait légèrement augmenté de 17 à 99 % dans le modèle par rapport au contrôle, mais statistiquement non significative (p > 0,05). Cependant, les expressions de ces protéines ont été considérablement augmentées dans les traitements AAE et AAE + LF. Les expressions de αA, αB, βA3, βA4, βB1, βB2, βB3 et γS étaient de 7,55-, 8,72-, 10,53-, 11,11-, 10,75-, 8,26-, 8,80- et 9,86 fois respectivement (Fig. 5B) dans AAE + LF, par rapport à ceux du modèle. Par rapport à l'AAE traité aux anthocyanidines uniquement, le traitement de l'AAE + LF a significativement augmenté l'expression de αA, αB, βA4, βB1, βB2 et γS de 51,69 %, 110,10 %, 74,19 %, 45,34 %, 52,58 %, 68,39 % ( Fig. 5B), et avaient tendance à augmenter l'expression de βA3 et βB3 de 26, 60% et 22, 95% (Fig. 5B), respectivement. Les résultats ont indiqué que le traitement combiné de l'AAE + LF a conduit à une régulation à la hausse beaucoup plus élevée des protéines cristallines protectrices dans l'état stressé. Le résultat similaire a également été obtenu dans l'analyse par immunotransfert (Fig. 5C). αA et γS n'ont pas été détectés dans les rétines de rats témoins et sont faiblement exprimés dans le modèle. Leurs expressions étaient évidemment augmentées dans l'AAE, et plus élevées dans l'AAE + LF que dans le traitement AAE (voir le dossier complémentaire).

En plus des modifications des protéines cristallines, l'expression de la caspase 3, une protéine régulatrice de l'apoptose, a significativement augmenté dans le Modèle par rapport au Contrôle (Fig. 5D). L'élévation a été légèrement supprimée dans le traitement AAE, mais significativement inhibée par le traitement AAE + LF. L'expression de la caspase 3 dans le groupe AAE + LF a été réduite de 51,38 % par rapport au modèle et de 44,34 % par rapport à l'AAE (Fig. 5D). Les observations suggèrent une apoptose régulée à la baisse dans les rétines de rat avec le traitement combiné AAE + LF.

La DMLA sèche induite par NaIO3 s'est avérée présenter un changement dans la composition du microbiote intestinal. Par rapport au témoin, la richesse et la diversité microbiennes intestinales ont eu tendance à augmenter dans le modèle endommagé par NaIO3, y compris l'indice Chao1 augmenté de 7,22 % et l'indice de Simpson augmenté de 8 %. Le traitement AAE ou AAE + LF a reconstruit la communauté microbienne intestinale, avec des indices Chao1 et Simpson inférieurs à ceux du modèle et des indices supérieurs à ceux du contrôle (Fig. 6A – C). PCoA et PLSDA ont révélé des différences dans la structure de la communauté microbienne avec des grappes séparées entre le contrôle et le modèle, tandis que la structure des traitements contrôle, AAE et AAE + LF avait tendance à être proche (Fig. 6D, E). Cependant, aucun indice n'a montré de signification statistique.

Modèles de structure du microbiote intestinal au niveau du genre dans les excréments de rats de différents traitements. (A) Courbe d'abondance de rang des genres microbiens totaux dans les fèces de rats. Le nombre d'unités taxonomiques opérationnelles (OTU) agit en fonction du nombre d'étiquettes de séquence échantillonnées ; (B, C) Boîtes à moustaches montrant la diversité α, y compris l'indice Chao et Simpson dans différents traitements ; (D, E) diagramme montrant la diversité β, y compris les résultats d'analyse de l'analyse en composantes principales (PCoA) basée sur les distances pondérées Unifrac du microbiote intestinal et l'analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLSDA) au niveau du genre.

Les abondances relatives des taxons au niveau du genre ont ensuite été comparées (Fig. 7A). Les Bacteroides, qui représentaient environ 40 % du total des taxons, représentaient l'abondance la plus élevée, et Lactobacillus, Alistipes, Parabacteroides, Akkermansia, Escherichia et Parasutterella étaient les principaux taxons (plus de 3 % de l'abondance moyenne) dans les 4 groupes. Il n'y avait pas de différence significative sur les abondances relatives des principaux taxons entre les différents groupes (Fig. 7A).

Altération du microbiote intestinal suite à différents traitements. (A) Abondance relative des genres bactériens ; (B) La taille de l'effet de l'analyse discriminante linéaire (LDA) (LEfSe) a été calculée pour explorer les taxons au niveau du genre qui discriminent plus fortement entre les différents groupes.

L'approche d'analyse métagénome LEfSe a été appliquée pour identifier les phylotypes clés responsables de la différence à chaque niveau parmi les 4 groupes. Membres des espèces Bacteroides vulgatus et L. reuteri dans Control ; l'ordre Campylobacterales, classe Epsilonproteobacteria, famille Helicobacteraceae, le genre Helicobacter dans Model ; les espèces B. fragilis et Alistipes timonensis, l'ordre Burkholderiales, la classe Betaproteobacteria et la famille Sutterellaceae en AAE ; l'espèce Parasutterella excrementihominis et le genre Parasutterella dans AAE + LF étaient significativement plus répandus que dans les autres groupes qui ont contribué à la différence du microbiote intestinal après différents traitements (Fig. 7B).

Les réponses ERG peuvent fournir des indices importants en rapport avec l'effet de l'intervention sur le fonctionnement de la rétine19. Dans nos résultats, le traitement combiné de l'AAE et de la LF a augmenté de manière significative les amplitudes des ondes a et b de l'ERG et a supprimé le trouble des couches cellulaires et l'amincissement de l'ONL, a montré une amélioration significative de l'atténuation des dommages à la rétine du rat par rapport aux anthocyanidines traitées uniquement. Les résultats ont indiqué que l'anthocyanidine combinée à L. fermentum NS9 présentait une meilleure protection des rétines de rat contre les dommages, à la fois sur le système de la tige et du cône, que l'aronia anthocyanidine traitée uniquement qui fonctionnait principalement sur le système de cône (Fig. 1 et 2).

Les effets protecteurs du traitement combiné (AAE + LF) sur la rétine du rat contre le stress oxydatif induit par le NaIO3 étaient probablement dus à l'augmentation de la capacité antioxydante et à la diminution de l'apoptose dans la rétine. Les activités GPx régulées à la hausse et la production de MDA supprimée ont été observées dans le groupe traité par AAE, mais une régulation à la hausse plus large des activités des enzymes antioxydantes, y compris SOD, CAT, GPx, et une suppression plus forte du niveau de MDA dans le traitement combiné AAE + LF (Fig. 4) . Kim et al. ont également découvert que le paprika fermenté avec L. plantarum pouvait atténuer la réduction médiée par NaIO3 des niveaux de SOD et de glutathion (GSH) dans les tissus oculaires des souris et augmenter l'effet protecteur de la dégénérescence rétinienne20.

Le stress oxydatif favorise la formation d'Aβ, qui est causée par le mauvais repliement et l'agrégation des protéines21. Les cristallines αA et αB appartiennent à la famille des protéines de choc thermique (HSP). Ils ont une grande affinité avec les protéines mal repliées pour protéger le RPE, les photorécepteurs et le RGC des dommages17,22. Dans nos résultats, les expressions cristallines αA et αB ont été régulées à la hausse de 7, 55 et 8, 72 fois dans les rétines de rat traitées avec AAE + LF par rapport au modèle, et ont augmenté de 51, 69% et 110, 10% sur la base du traitement AAE (Fig. 5B) . La forte expression de αA et αB cristallin dans la rétine peut empêcher l'apoptose induite par le stress oxydatif de l'EPR et des photorécepteurs, qui a été soutenue par la régulation à la baisse de la caspase 3 (Fig. 5D).

En plus des cristallines αA et αB, il a également été démontré que les protéines cristallines βA3, βB2 et γS protègent les RGC de la dégénérescence secondaire23. Nos résultats ont montré que le traitement combiné AAE + LF augmentait leur expression de 26, 60%, 52, 58% et 68, 39% par rapport à l'AAE seul (Fig. 5B). Des recherches antérieures ont identifié que les cristaux αB, βA1 / 3, βA4, βB2 et γS existaient dans les drusen, des dépôts basaux à l'EPR pouvant être associés à AMD24. Dans cette étude, nous avons observé que les expressions de αA, αB, βA3, βA4, βB1, βB2, βB3 et γS dans les groupes AAE et AAE + LF étaient toutes significativement régulées à la hausse par rapport au contrôle et au modèle. Bien que les mécanismes détaillés restent flous, nous pensons que la régulation à la hausse significative des cristallines est importante pour protéger la rétine des dommages antioxydants induits par le stress, de l'apoptose cellulaire et de la perte de structure et de fonction de la rétine, qui retardent ensuite le développement de la DMLA sèche.

Comparé au traitement AAE, AAE + LF a montré des effets améliorés significatifs sur la protection de la rétine de rat, ce qui suggère la fonction de L. fermentum NS9 sur la base de l'AAE. Les anthocyanidines sont largement distribuées dans les tissus végétaux où elles existent principalement sous forme de glycosides ou d'aglycones. L. fermentum a été signalé comme étant bénéfique pour le métabolisme des glucides25. Dans nos résultats, une augmentation significative de l'abondance relative de Parasutterella et de P. excrementihominis, connue sous le nom de souche saccharolytique, a été détectée après les traitements AAE + LF. En tant que membre central du microbiome, Parasutterella est un grand consommateur de L-cystéine, tandis que la L-cystéine joue un rôle important dans la régulation de la glycémie26. La proportion de Parasutterella a été augmentée par la consommation de glucides dans les modèles de rongeurs27. Il a été rapporté que P. excrementihominis joue un rôle important dans le maintien de l'immunité de l'hôte28. Certains probiotiques peuvent transformer le glycoside en aglycone pour favoriser son absorption. Une expression accrue de Parasutterella a été trouvée chez des souris ICR nourries avec du yogourt enrichi en flavonoïdes qui a été développé à l'aide de Lactiplantibacillus plantarum GY29. Dans l'intestin grêle, les anthocyanes sont principalement absorbées sous forme d'aglycones30. L'expression améliorée de Parasutterella dans le groupe AAE + LF peut améliorer la biodisponibilité des anthocyanidines et améliorer la fonction immunitaire. De plus en plus de recherches impliquaient que le microbiote intestinal jouait un rôle important dans de nombreuses maladies dégénératives liées à l'âge comme la MA et la DMLA9,31,32. Notre étude a présenté que L. fermentum NS9 combiné à un extrait d'anthocyanidine pourrait atténuer les dommages rétiniens induits par NaIO3, probablement grâce à l'amélioration de l'expression des cristallines rétiniennes, des capacités antioxydantes et de la dysbiose du microbiote. Le traitement combiné était significativement meilleur que l'extrait d'aronia anthocyanidine seul. Compléter à la fois avec L. fermentum NS9 et l'anthocyanidine pourrait être un moyen prometteur de prévenir et d'atténuer la dégénérescence de la rétine.

Les protocoles utilisés dans cette étude ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique animale de l'Institut de développement des plantes médicinales (n° SLXD-20201218031). Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la déclaration de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) pour l'utilisation d'animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. De plus, toutes les études animales ont été menées conformément aux directives ARRIVE. Quarante rats mâles Sprague-Dawley (SD) de 180 à 200 g ont été fournis par les National Institutes for Food and Drug Control (Pékin, Chine, n° SCXK2017-0005). Les animaux ont été maintenus à 22 °C et dans un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h (7 h à 19 h).

La souche L. fermentum NS9 a été inoculée dans du milieu MRS (gélose De Man, Rogosa et Sharpe) à 37 ° C pendant 12 h. Les bactéries ont été recueillies par centrifugation à 3000 tr/min pendant 5 min et lavées deux fois avec du tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4). La souche a été remise en suspension à une concentration de 108 unités formant colonies (UFC)/ml.

L'extrait d'aronia anthocyanidine était la poudre rouge violacée d'un extrait aqueux de fruits d'Aronia melanocarpa, acheté auprès de Greater Hinggan Gebei Frigid Zone Biotechnology Co., LTD (Heilongjiang, Chine). La poudre contient 10 % d'amidon (ajouté de manière exogène lors de la préparation de la poudre), 10,3 % d'anthocyanidine et d'autres nutriments hydrosolubles, notamment des saccharides, des protéines et des fibres alimentaires provenant des fruits d'Aronia melanocarpa.

Les rats ont été séparés au hasard en groupes de contrôle, modèle, AAE et AAE + LF. Dans le groupe AAE, un extrait d'aronia anthocyanidine à 600 mg/kg de poids corporel (anthocyanidine à 60 mg/kg de poids corporel) dans de l'eau distillée a été administré par voie orale une fois par jour pendant 28 jours. Dans le groupe AAE + LF, les rats ont été traités avec 60 mg/kg de poids corporel d'AAE et 108 UFC/ml de L. fermentum NS9 par jour pendant 28 jours. Dans les groupes témoins et modèles, les rats ont reçu par voie orale de l'eau distillée. Le modèle d'injection de NaIO3 murin est un modèle de DMLA largement utilisé16,17,18 et nous avions confirmé 30 mg/kg de poids corporel comme dose appropriée dans notre expérience préliminaire. Un seul traitement de NaIO3 à 30 mg/kg de poids corporel a été injecté par voie intraveineuse dans les groupes Modèle, AAE et AAE + LF le 8ème jour.

L'ERG plein champ des rats a été enregistré à l'aide d'un système d'enregistrement ERG (D430 Diagnosis, USA) comme indiqué précédemment13,33. Avant la mesure de l'ERG, les rats ont été adaptés à l'obscurité pendant 12 h. Vingt minutes avant l'enregistrement, les animaux ont été anesthésiés par injection intramusculaire avec le mélange de chlorhydrate de kétamine et de chlorhydrate de xylazine aux dosages de 100 mg/kg et 15 mg/kg, respectivement. Des gouttes ophtalmiques contenant 0,5 % de tropicamide et 0,5 % de chlorhydrate de phényléphrine ont été administrées aux yeux de rats pour dilater les pupilles. Les amplitudes des ondes a et b ont été enregistrées et analysées statistiquement.

Les deux yeux ont été retirés après euthanasie des rats par injection intramusculaire de chlorhydrate de kétamine associé à du chlorhydrate de xylazine. La rétine a été fixée et colorée avec H&E comme indiqué précédemment34,35. Pour chaque section, des images numérisées de la rétine entière ont été prises avec un appareil photo numérique (Leica DMi8, Wetzlar, Allemagne) à un grossissement de 200 ×. L'épaisseur de la couche nucléaire externe (ONL) a été mesurée avec le logiciel Image J (US National Institutes of Health, Bethesda, USA). Douze emplacements pour chaque section rétinienne ont été mesurés, en partant de chaque côté du nerf optique, chaque segment étant distant de 0,5 mm. Les 12 mesures ont été moyennées comme l'épaisseur moyenne de l'ONL.

Les échantillons de rétine prélevés sur les globes oculaires de rats ont été homogénéisés avec une solution saline de tampon phosphate (PBS, pH 7,4) et centrifugés à 3500 tr/min pendant 10 min, et le surnageant a été recueilli. Les activités de SOD, CAT, GPx et la teneur en MDA dans le surnageant de chaque échantillon ont été déterminées par spectrophotométrie à l'aide du kit de mesure (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine).

Les protéines de la rétine de rat ont été identifiées et analysées par MS en tandem selon le protocole précédent13. Les tissus de la rétine ont été lysés par sonication dans un tampon d'urée 8 M. Après digestion à la trypsine, les peptides ont été analysés sur un spectromètre de masse Orbitrap Q Ex-active HF couplé à un système en ligne de nano-chromatographie liquide haute performance (HPLC) EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, USA). Les résultats de la spectrométrie de masse ont été analysés et quantifiés à l'aide de PEAKS Studio (Waterloo, Canada).

L'analyse par immunotransfert a été effectuée comme indiqué précédemment13,36. La membrane avec les protéines de la rétine a été lavée avec du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tween/Tris (TBST) pour bloquer la liaison non spécifique, puis incubée avec des anticorps primaires contre la chaîne A de cristalline α et la cristalline S de γ. Choisissez Plus (#34577, Thermo Scientific) . Les transferts ont été coupés avant l'hybridation avec des anticorps pendant le transfert.

Les échantillons fécaux de rats ont été obtenus à la fin des traitements chez le rat dans la section "Effet des traitements sur l'expression des protéines cristallines et de la caspase 3 dans la rétine du rat" et immédiatement stockés à – 80 °C jusqu'à l'analyse. L'extraction de l'ADN microbien et l'analyse du métagénome ont été menées par Microeco Tech Co., Ltd. (Guangdong, Chine) comme indiqué précédemment37.

Pour l'analyse bioinformatique des séquences du microbiome, Kraken2 (v2.0.7) a été utilisé pour attribuer des lectures à la taxonomie et Bracken (v2.5.0) a été utilisé pour estimer avec précision l'abondance taxonomique. L'analyse LEfSe a été appliquée pour identifier les taxons bactériens différentiellement abondants parmi les groupes. Seuls les taxons ayant obtenu un score d'analyse discriminante log-linéaire (LDA) > 4 ont finalement été pris en compte. Pour déterminer le taux de fausses découvertes (FDR), la méthode de correction de tests multiples, Benjamini-Hochberg a été utilisée.

Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type. Les différences entre les groupes ont été évaluées par ANOVA unidirectionnelle, suivie du test de Tukey. p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de Prism 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions le professeur Lina Liang de l'hôpital ophtalmologique de l'Académie chinoise des sciences médicales chinoises pour son soutien technique et ses discussions. Ce travail est soutenu par le programme national de R&D clé de Chine (n° 2021YFA1302601).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yan Xing et Shan Liang.

Ces auteurs ont conjointement supervisé ce travail : Chenxi Jia et Feng Jin.

Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology for Plant Development, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou, 510631, Chine

Yan Xing, He Ni, Liu Yang et Hai-Hang Li

Laboratoire de recherche sur l'antioxydation et l'anti-âge, Guozhen Health Technology (Beijing) Co., Ltd., Pékin, 102206, Chine

Yan Xing, Limei Zhang, Xueqin Zhang, Jiancheng Wang et Shuangshuang Song

Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101, Chine

Shan Liang

State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Institute of Lifeomics, National Center for Protein Sciences (The PHOENIX Center), Beijing, 102206, Chine

Chenxi Jia

Key Laboratory of Mental Health, Institute of Psychology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101, Chine

Feng-jin

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YX, HL et FJ ont conçu l'expérience ; YX, LZ, XZ, JW et SS ont réalisé les expériences ; SL, HN, LY et CJ ont fourni des réactifs/matériels/outils d'analyse ; SL et CJ ont analysé les données ; YX a préparé le projet original ; SL, HL, CJ et FJ ont révisé le document. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit.

Correspondance avec Hai-Hang Li, Chenxi Jia ou Feng Jin.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Xing, Y., Liang, S., Zhang, L. et al. La combinaison de Lactobacillus fermentum NS9 et d'extrait d'anthocyanidine d'aronia atténue la dégénérescence de la rétine induite par l'iodate de sodium. Sci Rep 13, 8380 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34219-3

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Reçu : 02 novembre 2022

Accepté : 26 avril 2023

Publié: 24 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34219-3

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