Cellules triées hiPSC

Communications Biology volume 6, Article number: 483 (2023) Citer cet article

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Dernièrement, de nombreux systèmes microphysiologiques ont été utilisés pour modéliser le tube rénal proximal. Pourtant, il y a un manque de recherche sur le raffinement des fonctions de la couche épithéliale du tubule proximal - filtration et réabsorption sélectives. Dans ce rapport, des cellules pseudo tubules proximales extraites d'organoïdes rénaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme sont combinées et cultivées avec des cellules tubules proximales immortalisées. Il est démontré que le tissu cocultivé est un épithélium imperméable qui offre des niveaux améliorés de certains transporteurs, de collagène et de laminine de protéines de la matrice extracellulaire, ainsi qu'un transport du glucose et une activité de la glycoprotéine P supérieurs. Des niveaux d'expression d'ARNm supérieurs à ceux obtenus à partir de chaque type de cellule ont été détectés, suggérant une diaphonie synergique anormale entre les deux. Parallèlement, les améliorations des caractéristiques morphologiques et des performances de la couche tissulaire du tubule proximal immortalisé exposée, lors de la maturation, aux cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine sont soigneusement quantifiées et comparées. La réabsorption du glucose et de l'albumine, ainsi que les taux d'efflux des xénobiotiques par la glycoprotéine P ont tous été améliorés. Les données présentées côte à côte mettent en évidence les avantages de la couche épithéliale co-cultivée et de la bicouche non basée sur l'iPSC. Les modèles in vitro présentés ici peuvent être utiles dans les études de néphrotoxicité personnalisées.

Le tubule proximal situé sur la bande externe de la médullaire rénale est le principal site de réabsorption du sodium, de l'eau, des acides aminés et d'autres nutriments essentiels tels que le glucose et l'albumine qui auraient autrement été gaspillés par le filtrat glomérulaire1,2. L'organe est donc d'une importance cruciale et a fait l'objet de diverses tentatives de modélisation3,4,5,6,7.

Même si des données récentes mettent clairement en évidence les effets de la vascularisation endothéliale sur l'épithélium du tubule proximal6, il manque encore des recherches sur l'optimisation du tissu épithélial lui-même, car les modèles précédents utilisaient soit des cellules primaires, soit des lignées cellulaires immortalisées. Une option serait d'utiliser des cellules souches pour leur reproductibilité et leur capacité à offrir de bien meilleures caractéristiques in vivo. Néanmoins, il n'existe aucune source de cellules souches capables de produire des néphrons dans l'organe adulte car les progéniteurs de néphron sont tous épuisés à la naissance8,9,10, tandis que l'obtention de cellules progénitrices rénales à partir de rein embryonnaire peut sembler éthiquement inappropriée.

Alternativement, ces progéniteurs peuvent être recréés à partir de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) et différenciés directement en une variété de types de cellules rénales via des protocoles par étapes11,12,13,14. Bien que des cellules de type tubule proximal aient récemment été générées à partir de lignées iPSC directement à des fins d'évaluation sur puce15, en général, ces produits spécialisés ne disposent pas de la niche 3D présente in vivo.

À cette fin, nous lançons l'idée d'extraire des cellules d'organoïdes rénaux dérivés de hiPSC. Les organoïdes rénaux dérivés de hiPSC récapitulent les stades de développement tardifs, ont une structure 3D complexe et contiennent des cellules de toutes les lignées rénales, ce qui en fait des sources appropriées de cellules avec des caractéristiques plus in vivo. De plus, ils ne possèdent pas les défis éthiques liés à l'obtention et à la différenciation des progéniteurs de néphrons embryonnaires.

Plusieurs études ont avancé l'idée de générer des organoïdes rénaux en différenciant les cellules pluripotentes humaines (hPSC)13,14,16,17,18. Cependant, à partir des quatre populations de progéniteurs impliquées dans le développement du rein humain, à savoir les progéniteurs néphron, épithélial urétéral, endothélial et interstitiel rénal, la plupart de ces protocoles créent les deux premiers, ne formant que des néphrons ou des canaux collecteurs. Le processus de différenciation des hPSC en organoïdes rénaux introduit par Takasato et al. récapitule l'ensemble du cours de l'organogenèse rénale humaine19,20. Il a l'avantage de produire simultanément les quatre populations progénitrices impliquées dans la formation d'organoïdes rénaux par rapport aux méthodes rapportées antérieurement. De plus, ces organoïdes contiennent les principales structures présentes dans le rein humain. Dans le contexte de l'évaluation de la fonction cellulaire, il est avancé que l'exposition des organoïdes à des composés d'intérêt et l'évaluation de l'absorption cellulaire seraient problématiques car la polarité apicale/basolatérale correcte des cellules ne peut pas être affirmée dans l'agrégat15. Mais que se passe-t-il si ces cellules sont extraites et déposées sur une plate-forme 2D de manière à former une polarité correcte ?

Bien que des méthodes de différenciation directe des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh)21, des hPSC et des hiPSCs22 en cellules de type tubule proximal aient été rapportées et que quelques applications aient été établies, le consensus général est que l'absence de conditions in vivo telles que l'ECM est la raison de leur performance non optimale23.

Pour résoudre ce problème, quelques études ont avancé l'idée de mélanger ces cellules avec d'autres types de cellules telles que les cellules primaires. Par exemple, récemment Beauchamp et al. ont montré que la co-culture de fibroblastes cardiaques avec des cardiomyocytes hiPSC (hiPSC-CM) prolonge l'activité de battement spontané et améliore la fréquence et l'amplitude de la contraction par rapport aux iPSC-CM purs24. La perte conséquente d'expression de α-SMA a indiqué un modèle plus semblable à un tissu cardiaque dans la coculture. Bien sûr, il existe d'autres approches largement utilisées telles que la stimulation électrique qui peuvent ne pas être applicables aux cellules rénales25.

Ici, l'épithélium du tubule proximal a été formé sur un système microphysiologique, appelé tubule proximal sur puce (PToC), à l'aide de cellules extraites d'organoïdes rénaux dérivés de hiPSC. Les cellules qui ont été séparées par séparation cellulaire immunomagnétique (MACS) provenaient du tubule proximal, comme en témoigne l'immunocoloration contre les protéines spécifiques du tubule proximal et leur expression génique. Cependant, lors de la culture, les niveaux d'expression de ces marqueurs chutent de manière significative à la fois au niveau de l'ARNm et des protéines, laissant ouverte la question du potentiel des cellules dérivées d'organoïdes à fonctionner de manière appropriée. De plus, les cellules triées avaient tendance à récupérer leur niche organoïde et commençaient à former des agrégats, rendant impossible l'évaluation des performances de filtration du tissu sur la membrane de la puce microfluidique. Nous avons établi qu'une telle agrégation pouvait être considérablement réduite dans une coculture de rapport 1: 1 avec des cellules du tubule proximal immortalisées. Pour autant que nous le sachions, le concept de co-culture de deux types de cellules similaires, l'un immortalisé et l'autre obtenu à partir d'organoïdes dérivés de hiPSC, n'a pas encore été étudié.

À ce jour, de nombreux modèles microfluidiques 2D et bioimprimés 3D ont été développés pour le dépistage des médicaments et pour imiter la fonction de filtration du tubule proximal3,4,5,6,7. L'argument a été que les modèles 3D sont supérieurs car ils sont intégrés dans une matrice extracellulaire et peuvent donc récapituler la niche in vivo. Cependant, à notre connaissance, aucune analyse quantitative n'a été faite pour manifester un tel avantage. Dans ce projet, nous avons l'intention de revisiter la vision conventionnelle en formant une bicouche tissulaire 2D avec un espace épithélial/endothélial plus étroit que celui des modèles bio-imprimés 3D rapportés précédemment7. En fin de compte, nous évaluons le débit des processus de réabsorption et de cytopempsis de l'albumine et du glucose ainsi que la fonctionnalité du transporteur d'efflux P-glycoprotéine (Pgp), démontrant que même un bref contact avec les HUVEC améliore considérablement les taux de filtration.

L'auto-organisation 3D et la néphrogenèse commencent au jour 7, après la récolte du mélange de cellules progénitrices et la granulation sur des filtres transwell (Fig. 1a). Il a été établi que l'organoïde contient le pourcentage et l'état optimaux des cellules du tubule proximal au jour 22. La population EpCAM + (tubules rénaux) a été identifiée comme un surensemble de cellules du tubule proximal marquées par un marqueur de bordure en brosse, Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL), et plus spécifiquement par le transporteur d'albumine, la mégaline (Fig. 1b). Selon les estimations antérieures, l'organoïde contient environ 20 à 30 % de cellules de tubules proximaux19. Une reconstruction confocale 3D de l'organoïde est présentée (Films supplémentaires 1 et 2).

a Le protocole simplifié de différenciation hiPSC en mésoderme intermédiaire et formation d'organoïdes rénaux 3D, suivi de la dissociation, du tri et de l'ensemencement des cellules triées. Les organoïdes dissociés, LTL + et LTL–, font référence aux cellules organoïdes dissociées, à la fraction positive de MACS et à la fraction négative de MACS, respectivement. b Sélectionnez des images fluorescentes à fond clair et confocales (intensité z projetée) d'organoïdes rénaux au jour 22. L'immunochimie est pour EpCAM et les marqueurs de tubules proximaux, LTL et mégaline. c Effet de la concentration de LTL (facteurs de dilution de 1/50 ou 1/100) sur la spécificité de MACS, N = 4 expériences et les barres d'erreur représentent l'écart type des données, *p < 0,05. d Niveaux d'expression génique relatifs obtenus à partir de cellules triées et cultivées pendant 7 jours dans des boîtes de culture et PToC : organoïdes, cellules organoïdes dissociées au jour 22 ; LTL+/–, fraction positive/négative des produits MACS. La zone blanche correspond aux échantillons obtenus à partir de cellules dissociées (organoïdes) et triées, tandis que la zone grisée indique des échantillons de cellules cultivées pendant 7 jours. Les barres d'erreur représentent l'écart type avec N = 3 expériences biologiquement indépendantes. NS, non significatif pour p > 0,05 ; *p ≤ 0,05 ; ** p ≤ 0,01 ; ***p ≤ 0,001 ; ****p ≤ 0,0001. e Évolution des cellules LTL+ cultivées sur la membrane en agrégats, Barre d'échelle, 200 μm. Le cadre jaune montre la frontière entre l'agrégat de cellules et la monocouche. Barre d'échelle, 200 μm. f Immunochimie au jour 7 pour EpCAM, LTL et mégaline, marqueurs des tubules proximaux, dans des cellules triées extraites d'organoïdes rénaux et ensemencées sur le PToC. Pour les tissus LTL +, des balayages fluorescents ont été effectués sur des parties sélectionnées à proximité d'agrégats, comme encadré en (e). Barre d'échelle, 50 μm.

Au jour 22, les organoïdes ont été dissociés en une suspension cellulaire. La suspension a été partiellement exposée à LTL et soumise à MACS après que la concentration optimale d'anticorps a été déterminée (Fig. 1c). (Voir également la section «Méthodes» et le tableau supplémentaire 1 pour plus de détails.) Nous avons également examiné le FACS pour son degré de spécificité plus élevé et caractérisé les produits triés et cultivés (Fig. 1, 2 et données supplémentaires 1). Cependant, nous avons finalement opté pour MACS en raison de sa capacité à produire des cellules présentant des caractéristiques phénotypiques suffisamment similaires aux cellules primaires des tubules proximaux (films supplémentaires 3 à 6). Par la suite, les fractions positives et négatives des produits MACS ont été collectées et cultivées pendant 7 jours dans des conditions 2D ou lysées, triées, avec le reste de la suspension cellulaire. Pour déterminer si le compartiment du tubule proximal du néphron était présent dans nos organoïdes et examiner l'effet de la culture 2D, nous avons effectué une analyse de l'ARNm contre un certain nombre de gènes pertinents.

Nous avons constaté que le niveau d'expression de CDH6 (K-cadhérine), un marqueur spécifique des cellules progénitrices du tubule proximal16,26,27, augmentait au cours de la culture alors que l'augmentation était plus prononcée pour la fraction négative (LTL–). À savoir, les augmentations étaient respectivement de 2, 2 et 6, 2 fois pour les populations LTL + et LTL- (Fig. 1d). En revanche, l'environnement 2D n'était pas favorable pour le reste des marqueurs examinés, car les niveaux d'expression ont chuté (ABCB1, CUBN, LRP2, SLC3A1 et éventuellement SLC12A1) ou totalement diminué (SLC22A6 (OAT1)).

Le tissu cultivé à partir de cellules LTL + cultivées dans les puces (Fig. 3a, b supplémentaires) a commencé à s'agréger et à former de minuscules agglomérats de type sphéroïde sur la membrane (Fig. 1e). Néanmoins, l'immunocoloration a confirmé l'abondance des protéines des tubules proximaux dans ces cellules. EpCAM, LTL et mégaline sont apparus avec un contraste élevé, uniquement dans des agrégats de cellules LTL + qui se sont formés lentement et sont devenus discernables vers J7 (Fig. 1f). Aucun agrégat n'a été observé dans la couche de tissu LTL– (Fig. 3c supplémentaire).

Après MACS, les fractions LTL+ et LTL– ont été collectées et cultivées à 107 cellules mL–1. De plus, une coculture 50:50 de chacune des fractions avec des cellules épithéliales immortalisées du tubule proximal rénal (cellules RPTEC / TERT1, ci-après appelées RPTEC) a été examinée (Fig. 2a). Comme le montrent les images en champ clair (Fig. 2b), les cellules LTL + ont récupéré leur niche organoïde et ont commencé à s'agréger. Cependant, une fois co-cultivées avec des cellules RPTEC, elles se sont aplaties, permettant d'étudier la fonction barrière. Il est devenu clair que les cellules LTL + et RPTEC se mélangeaient bien, fournissaient une couche confluente et étaient positives à EpCAM (Fig. 2c). Alors qu'en revanche, bien que les cellules LTL- du mélange soient regroupées, elles ne pouvaient pas fusionner en un tissu continu. La couche épithéliale LTL+/RPTEC est ci-après dénommée la coculture. Les balayages laser confocaux dirigés des côtés apicaux vers les côtés basaux montrent l'expression de marqueurs de tubules proximaux apical (LTL, ZO-1 et Pgp) et basolatéral (EpCAM) (films supplémentaires 7–9).

a Chronologie (en jours) démontrant le test de coculture. Les hiPSC sont plaqués 23 jours avant la coculture comme indiqué précédemment, suivis des RPTEC qui sont sous-cultivés au jour -5. Les organoïdes rénaux sont récoltés lors de la maturation, dissociés et mélangés à parts égales avec les RPTEC. Le mélange de cellules est ensuite introduit dans la puce. b Images en fond clair montrant l'évolution des tissus LTL+ et co-cultivés dans le temps. Les cellules de la fraction positive seulement commencent à s'agréger à partir de ∼D4 et forment des sphéroïdes séparables par D7 (comme indiqué par les pointes de flèches rouges), ce qui rend le dispositif peu pratique pour les évaluations de filtration. Alors qu'aucun détachement n'est observé dans la coculture avec les RPTEC. Barre d'échelle, 200 μm. c Images fluorescentes projetées en intensité Z prises à partir d'échantillons immunocolorés à J7. DAPI, F-actine et EpCAM sont représentés respectivement en bleu, jaune et vert. Une fois co-cultivées avec des RPTEC dans un rapport 50/50, les cellules LTL+ se mélangent bien et forment une couche de tissu confluent. Cependant, la coculture de la fraction LTL- avec des RPTEC ne donne pas une couche de tissu confluent. Le tissu se détache partiellement comme indiqué par les pointes de flèches blanches. EpCAM est faiblement exprimé dans ce tissu et principalement dans les RPTEC. Les lignes pointillées grises montrent où se trouve la membrane PToC. Barre d'échelle, 200 μm. d Images fluorescentes, fond clair et fusionnées du tissu cocultivé à J14. Les rangées du haut montrent que le canal est couvert de manière égale par les RPTEC et les cellules LTL+ dans son intégralité. Les images à fort grossissement de la rangée du bas montrent que les cellules dissociées/triées dans le mélange forment non seulement de petits agrégats, mais sont également réparties presque uniformément dans tout le tissu de coculture. Les barres d'échelle sont en 1 mm et 100 μm sur les rangées supérieure et inférieure, respectivement. Les lignes pointillées doivent guider l'œil.

Pour les essais préliminaires, des hiPSC GFP-positifs ont été utilisés pour cultiver l'organoïde afin de faciliter le suivi des cellules triées. Il est devenu clair que dans le tissu de coculture, les deux types de cellules maintiennent leur conformité sur toute la couche. Les cellules dérivées d'organoïdes qui peuplent environ 50% de l'épithélium sont discernables (Fig. 2d). Au jour 14, les agrégats ont été assimilés dans la coculture, bien que certains amas subsistent encore. A ce stade, le tissu était considéré comme prêt à être caractérisé.

Apparemment, le marqueur de bordure en brosse est exprimé plus fortement dans les cellules LTL + dérivées d'organoïdes rénaux que dans les RPTEC. De plus, nous avons observé que dans le tissu de coculture, les cellules LTL + sécrètent leur propre ECM à proximité des RPTEC puisque la laminine et le collagène IV apparaissent de manière dense là où l'anticorps LTL est fortement exprimé. L'expression intense de Pgp dans la coculture peut suggérer une amélioration de la capacité d'élimination des substances exogènes. (Fig. 3a).

a Immunohistochimie pour LTL, hétérotrimère de laminine-111 (α1β1γ1), collagène IV et Pgp dans du RPTEC monocouche et des couches de tissus cocultivés au jour 14, mettant en évidence l'amélioration des deux protéines ECM dans ce dernier. Les amas liés à la laminine et au collagène, ressemblant morphologiquement aux amas épithéliaux d'îlots in vivo, apparaissent principalement autour des cellules LTL + triées des organoïdes, comme indiqué par les pointes de flèches blanches et vertes. Il en va de même pour la protéine apicale du tubule proximal, Pgp. Barres d'échelle, 30 μm. b Apparition de jonctions serrées autour des amas de cellules LTL+ à J7 et dans tout le tissu de coculture à J14. Dans (a) et (b), les pares d'image sont prises à partir du même échantillon et les barres d'échelle sont de 30 μm. c Évolution de la résistance électrique transépithéliale (TEER) avec le temps de culture pour les couches de tissu RPTEC uniquement et coculture. Dans le système de coculture, la résistance augmente plus fortement et atteint le premier plateau de deux (pointe de flèche vert clair), peut-être en raison de cellules LTL+ plus petites dans le mélange. Le deuxième plateau (pointe de flèche vert foncé) se produit presque au même moment où la résistance sature dans le système RPTEC uniquement, et correspond à la contribution des RPTEC dans le mélange (pointe de flèche bleu clair). La TEER est normalisée à la valeur finale à l'état d'équilibre du tissu RPTEC uniquement. N = 3 et 2 expériences indépendantes pour les cas de RPTEC uniquement et de coculture, respectivement. d Micrographies TEM mettant en évidence l'émergence et l'établissement de jonctions serrées (têtes de flèches rouge foncé) dans les monocouches de coculture à J7 et J14. Barre d'échelle, 1 μm. V, vacuole. e L'immunocytochimie de la mégaline et de la laminine-111 montre une amélioration de l'intensité de l'expression et de la distribution des deux protéines dans la coculture causée par le stress de cisaillement induit par le flux. Barre d'échelle, 50 μm (f) Les micrographies TEM de cellules représentatives du système de coculture comparent les conditions de culture statique et de culture de perfusion. La formation de diverses morphologies de tissus épithéliaux telles que des monocouches plates (qui couvrent presque toute la surface de la membrane), des monocouches avec des saillies cellulaires et des empilements de cellules avant à avant (apical-apical) est révélée dans cette dernière. Toutes les micrographies TEM proviennent des cellules fixées sur D14. Les barres d'échelle représentent 2 μm et 6 μm pour les micrographies représentant les conditions statiques (en haut) et perfusées (en bas), respectivement. M, mitochondries ; N, noyau ; mem, membrane PET. g Quantification de la longueur/densité des microvillosités et de la hauteur cellulaire dans le système de coculture à J14. Nous définissons la densité des villosités comme le nombre de saillies divisé par la longueur de la périphérie de la section transversale de la membrane cellulaire, mesurée à partir d'instantanés individuels. La contrainte de cisaillement induite par le flux a manifesté la croissance non seulement de microvillosités plus longues et plus denses, mais également de cellules plus hautes, témoignant d'une traduction de la morphologie squameuse à cuboïde. Tous les échantillons sont sur J14. À des fins de quantification, sur un total de N = 3 expériences TEM indépendantes par condition, n = 6, 5 et 24 cellules ont été sélectionnées au hasard pour mesurer respectivement la longueur des villosités, la densité des villosités et la hauteur des cellules. Les barres d'erreur représentent l'écart type des données.

L'effet synergique de la combinaison des cellules LTL + avec les RPTEC est également mis en évidence par une forte apparition de la protéine de jonction serrée. ZO-1 apparaît tôt à J7 dans la coculture (Fig. 3b), correspondant au premier plateau observé dans le profil TEER de la Fig. 3c. Dans ces graphiques, les lignes pleines et pointillées représentent une estimation lissée des tendances TEER pour les cas RPTEC et coculture, respectivement. Le premier plateau se produit à une date antérieure dans la coculture (comme indiqué par une pointe de flèche vert clair), indiquant une période d'inhibition de contact plus courte. Les cellules LTL + sont plus petites en moyenne et présentent une phase logarithmique plus raide. Les résistances convergent vers le jour 14, la coculture (tête de flèche vert foncé) étant légèrement plus résistante que le tissu RPTEC (tête de flèche bleu clair). Les jonctions serrées sont également visualisées dans les images TEM (Fig. 3d). Notre stratégie et notre configuration de mesure TEER ont été rapportées plus tôt28,29. Des images lumineuses déposées montrent l'évolution des couches de culture tissulaire sur les puces TEER avec le temps (Fig. 3d supplémentaire). La fonction de barrière claire de la couche épithéliale a été vérifiée avant d'effectuer des mesures de transport sur J14 (Fig. 3e supplémentaire).

Pour démontrer et quantifier les effets possibles du stimulus mécanique, nous avons exposé le côté apical du tissu à la contrainte de cisaillement induite par le flux. L'effet du flux de milieu sur la culture tissulaire est double. Contrairement à l'état stagnant, le flux aide non seulement à reconstituer les composants cruciaux du milieu, par exemple les facteurs de croissance et les hormones, mais exerce également une contrainte de cisaillement sur le tissu sous-jacent. Ces deux effets ont été rarement distingués dans la littérature des systèmes microphysiologiques rénaux. Ici, nous avons également fait circuler le milieu de culture dans des conditions de culture statique, mais avec un débit minuscule (1 μL min–1) pour garantir que la contrainte de cisaillement serait négligeable tout en maintenant l'approvisionnement en composants du milieu. De cette manière, nous avons pu discerner et étudier distinctement l'effet d'un stimulus mécanique sur le côté apical de l'endothélium. Les cellules des tubules proximaux sont connues pour répondre au stimulus de cisaillement dans une certaine plage. La contrainte de cisaillement continue le long du tubule proximal est mesurée pour varier de 0,1 à plus de 1 dyne cm–2 in vivo30,31. Cependant, en raison de la rétroaction tubuloglomérulaire, le flux instantané dans le tubule pourrait être pulsatile plutôt que régulier32. On s'attend à ce qu'à un débit donné, un flux pulsatile soit plus stimulant.

Auparavant, Long et al. ont observé que la différenciation cellulaire, la prolifération et, dans une certaine mesure, l'endocytose étaient améliorées à des niveaux de contrainte de cisaillement inférieurs33. Dans l'état du milieu perfusé, nous avons fait circuler le milieu à un débit de 10 μL min–1 résultant en une contrainte de cisaillement moyenne de 0,06 dyne cm–2, ce qui correspond à peu près aux valeurs minimales rapportées in vitro. En conséquence, nous pourrions en déduire que la nature pulsante instantanée de la pompe péristaltique (Fig. 4a, b supplémentaire) peut jouer un rôle dans les améliorations de la morphologie et de la fonction cellulaires observées ici. L'immunomarquage a révélé que même une si petite quantité de contrainte de cisaillement affecte remarquablement l'intensité et la distribution de la mégaline dans les épithéliums matures des systèmes de bicouche de coculture et non-iPSC.

Divers facteurs morphologiques et fonctionnels ont été améliorés. La mégaline, un cotransporteur de l'albumine, a été redistribuée dans le cytosol et il est évident que la sécrétion de laminine a été améliorée (Fig. 3e). La microscopie électronique a également révélé des altérations significatives de la morphologie des cellules. Outre les caractéristiques des cellules matures des tubules proximaux avec des structures de bordure en brosse, des zones riches en vacuoles et en mitochondries ont été observées dans les cellules co-cultivées. Les cellules exposées à un milieu fluide pendant seulement 3 jours ont subi une réduction de la surface apicale et basale qui indique un changement de phénotype squameux à cuboïde (Fig. 3f) 34,35. Nous avons également pu quantifier certains de ces changements géométriques en analysant un grand nombre d'images TEM. Comme illustré dans les graphiques de la figure 3g, les cellules co-cultivées ont grandi et développé des microvillosités plus longues et plus denses. À ces fins de quantification, nous avons uniquement compté les cellules de la monocouche et ignoré les petites fractions du tissu contenant des cellules stratifiées.

Par rapport à l'une ou l'autre source cellulaire, les niveaux d'expression d'ARNm de certains gènes clés étaient élevés dans l'épithélium cocultivé (Fig. 4a). Cependant, des écarts ont été observés entre ces niveaux et les niveaux d'expression protéique des marqueurs correspondants, tels que révélés par l'immunocoloration. Par exemple, bien que ABCB1 ait été exprimé à peu près au même niveau dans les échantillons de tissus RPTEC et de coculture, Pgp a été trouvé plus abondamment dans ces derniers. Les transporteurs de glucose et d'albumine, SGLT2 et LRP2, respectivement, étaient tous deux élevés dans les niveaux d'ARNm et de protéines. LRP2 a été étonnamment augmenté de plus de 100 fois.

a Les niveaux d'expression de certains gènes dans la coculture RPTEC/LTL+ montrent une amélioration par rapport à ceux de chaque composant. Fonctionnel, ABCB1 (MDR1), AQP1, LRP2, SLC22A2 (OCT2), SLC5A2 (SGLT2) et structurel, CDH6 (K-Cadhérine) et EpCAM, les niveaux relatifs d'expression génique (versus ceux du niveau ACTB), sont accompagnés de quantités relatives (normalisées aux valeurs du tissu RPTEC). À l'exception d'ABCB1 et d'EpCAM, les niveaux d'expression d'autres gènes ont été significativement augmentés dans le tissu co-cultivé. Il n'y avait aucun effet néfaste sur les niveaux d'expression de l'ARNm ; N = 2 et 5 expériences biologiquement indépendantes pour les monocultures RPTEC/LTL+ et le cas de la coculture, respectivement ; Les barres d'erreur représentent l'écart type des données. Taux de réabsorption du glucose (b) et perméabilités apparentes (Papp) à Rh123 (c) mesurés à J14 pour les couches de tissus en RPTEC uniquement et en coculture soumises à des conditions de culture statiques et perfusées. Le transport vectoriel est vérifié dans tous les cas. Les taux de transfert ont été estimés en procédant à une régression linéaire sur les données chronologiques. a → b, apical à basal ; b → a, basal à apical ; Mesures prises à partir d'un minimum de N = 3 puces indépendantes ; Les barres d'erreur représentent l'écart-type de la moyenne ; NS, non significatif pour p > 0,05 ; *p ≤ 0,05 ; **p ≤ 0,01 ; ***p ≤ 0,001 ; ****p ≤ 0,0001.

Nous avons émis l'hypothèse qu'une telle augmentation des niveaux de protéines de transport pourrait conduire à une amélioration du transport transépithélial actif. Pour tester notre hypothèse, nous avons quantifié le taux de réabsorption du glucose et le taux d'excrétion de la rhodamine 123 (Rh123), comme mesures de l'activité SGLT2 et Pgp, respectivement. Nous avons montré que les taux de transport apical à basal (a → b) du glucose dans la coculture étaient améliorés d'environ 1, 75 et 2, 50 fois par rapport à la monocouche RPTEC uniquement dans des conditions de culture statique et perfusée, respectivement (Fig. 4b). Parmi les quatre conditions examinées, alors que les taux de transfert a → b du substrat étaient significativement plus élevés que ceux de la direction inverse (b → a), il n'y avait pas de changements significatifs dans les taux de transfert inverse. Les deux observations confirment la nature vectorielle du transport du glucose.

Les perméabilités apparentes (Papp) au substrat Pgp, Rh123, sont illustrées à la Fig. 4c. Les taux d'excrétion (b → a) étant supérieurs aux taux d'absorption (a → b), le transport est unidirectionnel dans les quatre cas examinés. De plus, le taux d'efflux du substrat, défini comme le rapport des taux d'excrétion sur les taux d'absorption, a été augmenté de 90 % dans le système de coculture dans des conditions de culture statique, confirmant une amélioration substantielle de la capacité de dépôt xénobiotique.

Pour créer des canaux épithéliaux et endothéliaux péritubulaires proximaux complètement isolés, nous avons adapté notre protocole pour garantir la formation d'un tissu RPTEC parfaitement scellé avant l'introduction des HUVEC (Fig. 5a). Cela a non seulement empêché le mélange d'EGM2 et de REGM qui aurait autrement provoqué le détachement des HUVEC (Fig. 4c, d supplémentaires), mais nous a également permis d'étudier les effets des cellules endothéliales sur un tissu épithélial de tubule proximal mature. Avant l'ensemencement, nous avons revêtu la membrane des deux côtés uniquement avec un agent d'adhésion cellulaire et avons permis aux cellules de sécréter leur propre ECM. Bien qu'aucune protéine ECM externe n'ait été appliquée, la bicouche a été maintenue en toute sécurité pendant au moins 10 jours, après quoi les HUVEC ont commencé à se détacher (Fig. 4e supplémentaire et films supplémentaires 10 et 11).

a Le calendrier des processus génériques d'ensemencement et de maintenance des cellules. Les HUVEC ne sont pas inclus pour les dispositifs monocouches. b Évolution dans le temps des résistances rapportées des couches de tissu RPTEC uniquement (cercles bleus), bicouche (carrés rouges) et HUVEC uniquement (triangles verts). Pour les dispositifs bicouches, une fois les HUVEC introduits à J10, la résistance globale saute lors de la formation d'une couche endothéliale confluente puis commence à décliner jusqu'à atteindre un état d'équilibre à J14/j4. Les lignes pointillées indiquent les résistances moyennes obtenues sur les 4 derniers jours de culture (barres colorées) pour chaque cas. Toutes les valeurs mesurées sont normalisées à celle du RPTEC TEER en régime établi, soit 60 Ω cm2 (trait pointillé bleu). Les flèches vertes et rouges à deux têtes indiquent, respectivement, la résistance rapportée de la couche HUVEC uniquement et l'incrément de résistance mesuré lors de l'ajout d'HUVEC au tissu RPTEC uniquement. Une bicouche stable se forme sur D14/d4. Les RPTEC ont été cultivées sur N = 6 dispositifs, dont N = 3 ont été rendus bicouches lors de l'ajout de HUVEC à J10. N = 3 appareils étaient dédiés au tissu HUVEC uniquement. c Immunohistochimie pour ZO-1, EpCAM et mégaline dans le tissu RPTEC du système bicouche ainsi que des images fluorescentes des HUVEC correspondants marqués RFP, montrant l'évolution des jonctions serrées, le degré de réépithélialisation et la distribution du transporteur d'albumine, respectivement. L'activité et l'intégrité des tissus sont maximales entre J14/j4 et J17/j7. Barre d'échelle, 50 μm. d Effet des HUVEC sur l'intensité de l'expression de ZO-1 ; En présence de HUVEC, des jonctions serrées sont apparues à partir de J14/j4 (pointe de flèche verte) et sont devenues clairement visibles à J17/j7, alors qu'en l'absence de HUVEC, elles sont apparues faiblement, même à une transmissivité laser confocale considérablement plus élevée. Aucun Triton X n'a ​​été utilisé dans cette expérience. Les barres d'échelle sont de 100 μm. Toutes les images fluorescentes sont projetées en intensité z confocale. Barre d'échelle, 100 μm.

Semblable au système de coculture monocouche, nous avons sondé la résistance électrique globale du système RPTEC/HUVEC pendant tout le cours de la culture par intervalles. Des dispositifs avec des tissus RPTEC et HUVEC monocouches ont été utilisés à des fins de comparaison et toutes les valeurs ont été mises à l'échelle par rapport au RPTEC TEER moyen mesuré au cours des 4 derniers jours de culture, soit 60 Ω cm2 (Fig. 5b). La résistance globale dépasse lors de la formation d'une monocouche HUVEC confluente de D10/d0 à D13/d3, puis se stabilise au-delà de d4. Cependant, l'amplitude du saut de résistance lors de la création de la bicouche, comme indiqué par la flèche rouge sur la figure 5b, n'est pas significativement différente de la résistance du tissu HUVEC uniquement (flèche verte). En conséquence, même si le profil de résistance de la bicouche semble stable au cours de la culture, il est peu probable que l'introduction des HUVEC ait affecté de manière significative la résistance transépithéliale de la couche RPTEC. Habituellement, les cultures monocouches RPTEC présentent des TEER autour de 0,1 à 1 kΩ cm2 36,37, tandis que le tissu du tubule proximal in vivo est connu pour afficher des valeurs qui sont d'un ordre de grandeur plus petit. Il est souvent avancé que la fonction de barrière plus perméable du tissu in vivo est due à un transport transcellulaire ou paracellulaire plus élevé38. Apparemment, et peut-être pour la même raison, les valeurs de résistance de quelques dizaines de Ω cm2 mesurées ici se situent entre celles des valeurs précédemment rapportées pour les monocouches RPTEC et le tissu du tubule proximal in vivo. Plus tard, nous établissons que les HUVEC jouent effectivement un rôle dans une telle amélioration.

Il est bien établi qu'un réseau de signalisation paracrine se forme une fois que les RPTEC sont co-cultivés avec des cellules endothéliales, ce qui améliore le taux de prolifération et la différenciation des RPTEC39. Dans notre cas, la preuve d'une interaction et d'une telle signalisation entre les HUVEC et les RPTEC était discernable à partir du d4 de la formation de la bicouche. Nous avons observé qu'en présence de HUVEC, l'intégrité du tissu épithélial et éventuellement la fonction des deux culminent entre les jours 4 et 7 de la formation de la bicouche, comme en témoigne l'apparition inébranlable d'EpCAM / ZO-1 et l'expression de la mégaline dispersée au maximum (uniformément distribuée) le jour 7 (Fig. 5c). Étant donné que la mégaline est un transporteur mobile d'albumine, une meilleure libération cytosolique de l'albumine, déjà présente dans le milieu de culture, est conclue.

Ceci est remarquable car contrairement à certains rapports antérieurs où les deux types de cellules ont été réunis presque en même temps6, nous observons une amélioration de l'intégrité et de la fonction des tissus des tubules proximaux même après 10 jours de culture. Comme observé par microscopie électronique à transmission en coupe (MET), les pores de 3 μm de large de la membrane PET étaient les seuls canaux possibles par lesquels ces deux types de cellules pouvaient communiquer (Fig. 3b supplémentaire). En effet, une porosité d'environ 5% était suffisante pour établir un contact cellule-cellule suffisant. De plus, le niveau d'expression de la protéine de jonction serrée RPTEC a été nettement augmenté dans le système bicouche (Fig. 5d) comme dans un rapport précédent6, tout comme sa fréquence d'apparition. De ce fait, toutes les caractérisations et évaluations fonctionnelles ont été centrées sur le D14 de la culture de la couche épithéliale quelle que soit la source cellulaire. Notez que ZO-1 a été exprimée de manière éclatante dans le tissu de coculture à J14, alors qu'elle est faiblement apparue dans le système monocouche RPTEC uniquement dans les mêmes conditions de culture. Le système bicouche RPTEC/HUVEC a été soumis à un degré d'examen similaire à celui du tissu de coculture.

Nous avons estimé les modèles d'expression spatio-temporelle de certaines protéines spécifiques aux tubules proximaux en effectuant des observations approfondies d'immunofluorescence. En bref, les intensités fluorescentes représentant les niveaux d'expression de plusieurs anticorps ont été quantifiées en analysant des piles d'images confocales prises à travers les membranes chargées de cellules. La procédure est illustrée à l'aide d'images fluorescentes en coupe transversale représentatives de la bicouche RPTEC/HUVEC et des profils d'intensité correspondants (Fig. 6a, b). Ad désigne la distance entre les positions du niveau d'expression de pointe de chaque anticorps et le niveau d'expression de pointe de DAPI, en tant que mesure de la localisation des noyaux. En traçant les valeurs de Δd par rapport aux jours de culture, nous avons pu retracer la motilité des protéines dans la couche épithéliale.

a Sélectionnez une image confocale fluorescente en coupe transversale du système de bicouche RPTEC/HUVEC, immunocolorée pour la mégaline, illustrant la définition de la distance relative de la protéine d'intérêt (par exemple la mégaline) mesurée à partir du centre des noyaux. Les barres d'échelle sont de 10 μm. b Profils d'intensité z représentatifs des signaux fluorescents obtenus en faisant la moyenne des intensités d'émission de divers marqueurs sur une zone de balayage laser de 0,1 cm2 avec un Δz (pas) de 200 nm. Distance moyenne entre le marqueur spécifique du tubule proximal et les noyaux dans les RPTEC (bicouche) obtenues dans des conditions de culture statiques et perfusées pour ( c ) la mégaline, ( d ) LTL et ( e ) SGLT2; N = 2 puces indépendantes ont été utilisées pour effectuer n = 3 mesures aléatoires à partir de chacune ; Les barres d'erreur indiquent l'écart type. Les différences statistiquement significatives entre les paires de données sont indiquées par des astérisques, *, **, ***, ****, pour p ≤ 0,05, 0,01, 0,001 et 0,0001, respectivement. Certaines images TEM en coupe mettent en évidence l'apparence de la membrane apicale des RPTEC dans diverses conditions de culture à J14/j4 : (f) couche unique sous statique, (g) bicouche sous statique et (h) couche unique dans des conditions de culture de perfusion. Le gros plan TEM de (i) révèle une jonction serrée (pointe de flèche jaune) formée entre deux RPTEC adjacents sous culture de perfusion. j Une HUVEC du côté opposé de la membrane. Les barres d'échelle sont de 2 μm. Toutes les micrographies proviennent des cellules fixées sur D14/d4. M, mitochondries ; N, noyau ; V, vacuole ; mem, membrane PET, les flèches pointent vers des jonctions serrées et les lignes pointillées montrent les limites cellule-cellule. k Quantification de la longueur/densité des microvillosités et de la hauteur du RPTEC. Nous définissons la densité des villosités comme le nombre de saillies divisé par la longueur de la périphérie de la section transversale de la membrane cellulaire, mesurée à partir d'instantanés individuels. Les RPTEC/HUVEC sont en D14/d4. Il est clair que les RPTEC à proximité des HUVEC ont développé des microvillosités apicales plus denses, résultant en une surface plus élevée. De plus, la distribution de la densité des microvillosités est plus étroite dans la configuration bicouche. Aucune différence significative dans la longueur des villosités n'a été observée entre les cas monocouche et bicouche en condition de culture statique. La contrainte de cisaillement induite par l'écoulement s'est manifestée non seulement plus longtemps mais aussi par une plus grande densité de microvillosités. À des fins de quantification, sur un total de N = 3 observations TEM indépendantes par condition, n = 9, 5 et 5 micrographies RPTEC ont été sélectionnées au hasard parmi des conditions de culture monocouche (statique), bicouche (statique) et monocouche (flux), respectivement, pour mesurer les longueurs et les densités des villosités. Pour mesurer la hauteur des cellules, n = 8 et n = 9 micrographies ont été examinées pour les conditions statiques et d'écoulement, respectivement. Les barres d'erreur représentent l'écart type des données. l Distances moyennes des protéines du sous-sol et apicales par rapport au noyau illustrées pour les tissus RPTEC uniquement et de coculture développés dans des conditions de culture en flux. Données obtenues par profilage d'intensité z d'images fluorescentes. Les statistiques sont dérivées d'une manière similaire à (c–e).

Pour le cas de la mégaline, plus elle apparaît loin des noyaux, plus elle a de chances d'être liée à la membrane apicale, c'est-à-dire de rester à un état inactif. Nous avons remarqué que dans le système bicouche, si les HUVEC sont ensemencées en premier, la mégaline initialement exprimée au niveau de la membrane apicale s'internalise pendant 7 jours de culture RPTEC (Fig. 5a supplémentaire). Alors que, lorsque les RPTEC sont ensemencés en premier, ils seraient complètement absorbés dans le milieu intracellulaire à J14, suggérant un pic d'activité d'endocytose (Fig. 6c et Supplémentaire Fig. 5b)40. Les données présentées ici et les images fluorescentes de la figure 3e montrent clairement que la perfusion augmente non seulement l'activité de la mégaline, mais également son abondance dans le cytosol. Une telle amélioration se traduit par un taux de réabsorption plus élevé de l'albumine. Conformément aux rapports précédents sur l'augmentation de la hauteur / compacité des cellules sous contrainte de cisaillement des fluides31, nous avons constaté ici par profilage des protéines que les marqueurs apicaux, LTL et SGLT2, semblaient plus éloignés du noyau (Fig. 6d, e).

La microscopie électronique en coupe des cellules de la couche supérieure au jour 14 a révélé les effets distinctifs de la contrainte de cisaillement et de la proximité avec les HUVEC sur les épithéliums non-iPSC également (Fig. 6f – j). Composants ECM auto-sécrétés diffusés à travers les pores de la membrane fournissant une voie de communication avec les HUVEC. Même si les cellules étaient squameuses par rapport aux structures tubulaires 3D5,7, les jonctions serrées étaient clairement discernables. L'observation des jonctions serrées confirme la nature imperméable des épithéliums de coculture RPTEC uniquement et RPTEC/LTL+ et est essentielle pour valider nos évaluations de transport transcellulaire. Les jonctions serrées dans le tissu RPTEC uniquement ont commencé à se former à un stade ultérieur que celles du système monocouche de coculture. Il semble également qu'ils deviennent plus serrés sous culture par perfusion, bien que cela n'ait pas été confirmé statistiquement (Fig. 6 supplémentaire).

Quelle que soit la source de cellules épithéliales, la densité et la longueur des villosités ainsi que la hauteur des cellules ont toutes augmenté sous l'influence de la contrainte de cisaillement, ressemblant à la condition in vivo. Fait intéressant, même en l'absence de stimuli mécaniques, des villosités plus denses sont apparues sur les RPTEC en contact avec les HUVEC (Fig. 6k). Une population plus grande et plus dense de villosités se manifeste par une endocytose et une transcytose plus efficaces.

À J14, nous avons mesuré les distances relatives moyennes des protéines du sous-sol (laminine et collagène IV), sous-apicales (ZO-1) et apicales (Pgp) par rapport au noyau dans les systèmes monocouche RPTEC uniquement et de coculture (Fig. 6l). Étant donné que l'ECM et les protéines apicales sont exprimées plus loin des noyaux dans le tissu cocultivé, il est constaté que les cellules du tubule proximal du tissu cocultivé ont grandi en moyenne. Sans aucun doute, le tissu RPTEC a une épaisseur plus uniforme à travers la membrane et le degré collectif d'orientation et de polarisation des cellules est plus élevé (barres d'erreur plus petites pour Pgp et ZO-1). Notez également que ZO-1 est exprimé clairement sous la Pgp apicale dans le tissu RPTEC uniquement. La quantification des hauteurs de cellules basée sur les observations TEM de cellules individuelles n'a pas tout à fait conduit aux mêmes résultats que ceux présentés sur la figure 6l ; cependant, la tendance était similaire. Nous croyons que les racines de l'écart dans le processus de profilage d'intensité z où les distances relatives moyennes mesurées entre les marqueurs apicaux et basaux sont raccourcies parce que la membrane PET n'est pas plate. De plus, étant donné que les protéines apicales ne sont pas nécessairement exprimées directement sur le pic des cellules, la mesure des hauteurs cellulaires de la membrane à l'apex cellulaire entraînerait des valeurs plus élevées. Cela dit, l'effet de la contrainte de cisaillement sur la hauteur des cellules était plus prononcé dans la coculture, c'est-à-dire une augmentation de 37 % du tissu RPTEC uniquement contre 99 % dans la coculture (hauteur des cellules sur la Fig. 3g et la Fig. 6k).

Le protocole de formation de la bicouche RPTEC/HUVEC est à nouveau représenté sur la figure 7a. Pour déterminer si la présence de HUVEC affecterait les marqueurs de la structure et de la fonction des tubules proximaux, nous avons effectué une analyse qPCR. Outre les améliorations morphologiques observées dans la membrane apicale microvillaire, nous avons remarqué que les niveaux d'ARNm de certains gènes RPTEC sont augmentés sous le stress de cisaillement induit par le flux et en présence de HUVEC. D'une part, AQP1, EpCAM, MDR1, OCT2 et éventuellement SGLT2 sont régulés à la hausse dans le système de bicouche mature soumis au flux de perfusion, d'autre part la proximité avec les HUVEC sous perfusion de milieu a entraîné une augmentation des niveaux d'expression de AQP1, EpCAM, MDR1 et OCT2 (Fig. 7b).

a Le protocole générique pour la quantification de la réabsorption et de l'excrétion rénales à l'aide de la PToC. Les mesures commencent le jour 14, quel que soit le test en cours et la configuration de la couche tissulaire. Les médias dans les microcanaux épithéliaux et vasculaires sont mis en circulation pour améliorer la diffusion des substrats à grandes molécules (par exemple BSA-AF488). Les taux de transfert (réabsorption de l'albumine/glucose ou perméabilité apparente à Rh123) ont été estimés en effectuant une régression linéaire sur les données d'évolution dans le temps. b Niveaux d'expression relatifs (vs. ACTB) des gènes structuraux, CDH6 (K-Cadhérine) et EpCAM, et des gènes fonctionnels, à savoir ABCB1 (MDR1), AQP1, SLC22A2 (OCT2), SLC5A2 (SGLT2), par rapport au niveau du gène ACTB dans les systèmes RPTEC uniquement et RPTEC/HUVEC. Quatre groupes sont présentés, à savoir, (i), les RPTEC à J14 dans les boîtes de culture ; (ii), RPTECs de la bicouche en condition de culture statique ; (iii), RPTECs de la bicouche dans des conditions de culture perfusées ; (iv) RPTEC monocouche sous milieu perfusé. La proximité avec les HUVEC sous perfusion de milieu a augmenté les niveaux d'expression de AQP1, EpCAM, MDR1, OCT2 et SGLT2 (comparer les groupes iii et iv). Indépendamment, la perfusion a augmenté les niveaux d'expression des mêmes gènes (à l'exception possible de SGLT2) dans la co-culture (comparer les groupes ii et iii). n = 5 répliques de PCR ont été analysées pour chaque gène/échantillon obtenu à partir d'un ensemble d'expériences. c Taux de transfert de la sonde de glucose, 2NBDG mesurés dans des conditions de culture statiques et perfusées. Les taux de réabsorption (a → b) et de transfert inverse (b → a) ont été quantifiés. L'effet inhibiteur de la phlorizine (P.) sur le transport du glucose a également été examiné ; n = 3 puces indépendantes. d Perméabilités apparentes à Rh123 dans les deux sens d'excrétion (b → a) et inverse (a → b). Le vérapamil (V.), un candidat à l'extrusion de Rh123, a été appliqué pour atténuer l'efflux de Rh123 et confirmer la fonction de Pgp ; N = 3 puces indépendantes. e Images confocales fluorescentes empilées en z de la couche de tissu RPTEC dans des configurations bicouche et monocouche. Une quantité considérablement plus élevée de BSA a été précipitée dans le milieu basolatéral des RPTEC dans le système bicouche indiquant une absorption plus élevée du substrat. Du BSA est précipité dans le RPTEC monocouche sur J17 (pointe de flèche blanche). La barre d'échelle est de 50 μm. f Taux de transport de l'albumine sérique bovine conjuguée à l'AF488 (BSA-AF488) dans les deux sens. Dans cette étude, nous avons examiné l'effet de la réduction de la température d'incubation (à 4 ° C) sur le transport sélectif de BSA-AF488 ; minimum N = 6 puces indépendantes. Dans (b – d, f), un test t à deux échantillons a été exécuté entre deux ensembles de données, comme indiqué. Les barres d'erreur représentent l'écart type ; ND, non détecté ; N/A, non disponible ; NS, non significatif ; *, **, ***, ****, pour p ≤ 0,05, 0,01, 0,001 et 0,0001, respectivement. a → b, apical à basal ; b → a, basal à apical.

Ainsi, nous nous attendions à ce que l'épithélium amené à proximité des HUVEC puisse présenter non seulement une structure plus dense, mais également des taux d'élimination des xénobiotiques et d'absorption du glucose plus élevés. Ces suppositions ont été confirmées par des évaluations approfondies des taux de réabsorption du glucose et d'excrétion de Rh123, indiquant que le niveau de protéines correspondant à SGLT2 et MDR1 (SGLT2 et Pgp) était également augmenté (Fig. 7c, d). Les taux de réabsorption du glucose a → b étaient significativement améliorés en présence de HUVEC et sous flux de perfusion, indépendamment, alors que les taux b → a étaient presque inchangés. De plus, la phlorizine, en tant qu'inhibiteur compétitif classique de SGLT1 et de SGLT241,42,43, a bloqué efficacement la réabsorption du glucose.

Bien que LRP2 n'ait pas été détecté de manière stable, la présence et le bon fonctionnement de la mégaline ont été confirmés dans les RPTEC en analysant les taux de réabsorption de l'albumine. Nous avons montré que la capacité d'absorption d'albumine des RPTEC augmente considérablement en présence des HUVEC. Ceci est mis en évidence par l'accumulation de BSA dans le côté basolatéral des RPTEC dans le système bicouche (Fig. 7e). De plus, la bicouche présentait un taux plus élevé de transcytose de l'albumine a → b (Fig. 7f). L'abaissement de la température pendant les mesures semble avoir considérablement réduit les taux de réabsorption comme étudié précédemment44,45.

Ces résultats sont intéressants, notamment parce que les taux de réabsorption et d'excrétion sont augmentés même si, intuitivement, la couche endothéliale peut gêner le transfert de toute biomolécule à travers les canaux. La signalisation paracrine entre les deux types de cellules a amélioré la fonction de la mégaline, du SGLT2 et de la Pgp dans la mesure où le glucose, l'albumine et le Rh123 sont tous transférés à des taux considérablement plus élevés à travers le tissu bicouche. De plus, les microvillosités apicales sont devenues plus denses dans les RPTEC cocultivés avec les HUVEC même en l'absence de stimuli mécaniques (Fig. 5k). Notez que dans le système bicouche RPTEC/HUVEC, il n'y a pas eu d'amélioration tangible du taux d'efflux global de Rh123, alors que les taux de réabsorption du glucose et de l'albumine ont tous deux augmenté. Enfin, nous avons évalué la capacité du transporteur xénobiotique basolatéral, OCT2, dans les systèmes monocouche et bicouche. OCT2 est responsable de l'absorption de médicaments chimiothérapeutiques tels que l'oxaliplatine et le cisplatine qui sont connus pour provoquer des lésions rénales d'origine médicamenteuse46. En utilisant la cimétidine comme inhibiteur d'OCT2, nous avons montré l'absorption sélective d'EtBr fluorescent cationique et l'absorption vectorielle de 4-Di-1-ASP (ASP +), tous deux connus sous le nom de substrats d'OCT2 (Fig. 7 supplémentaire). Cependant, contrairement aux tests de filtration sur l'albumine, le glucose et le Rh123, où les HUVEC se sont avérés améliorer les taux de transport dans la bicouche, la couche unique RPTEC était plus efficace pour absorber l'ASP+ car le substrat était bloqué par les HUVEC.

Nous rapportons l'ingénierie d'un tissu tubulaire proximal 2D en combinant des cellules extraites d'organoïdes rénaux dérivés de hiPSC (LTL +) avec des cellules RTPEC/TERT1 humaines différenciées. La couche de tissu artificiel a affiché une capacité de filtration/réabsorption améliorée par rapport à son homologue non basé sur l'iPSC. De plus, les niveaux d'expression d'ARNm de certains gènes spécifiques aux tubules proximaux ont été amplifiés dans la coculture, ce qui signifie des degrés plus élevés de maturité et de fonction. Notre épithélium modifié, composé de cellules parfaitement fusionnées dérivées d'organoïdes rénaux et immortalisées, pourrait maintenir de manière stable sa conformité au moins jusqu'au 14e jour.

Comme indiqué dans le protocole, au cours de la différenciation intermédiaire du mésoderme, le rapport du mésenchyme métanéphrique aux progéniteurs de l'épithélium urétéral peut être ajusté en choisissant le jour du commutateur CHIR-à-FGF919. Une date de commutation ultérieure produira plus de la première, donnant ainsi naissance au mésenchyme de la coiffe et conduisant à plus de néphrons. Puisque nous sommes simplement intéressés par la récolte de cellules semblables à des tubules proximaux, nous avons choisi la date la plus tardive du changement (jour 5). L'augmentation substantielle du niveau d'expression de la K-cadhérine observée après la culture 2D, rapportée précédemment, peut être attribuée au taux de prolifération plus élevé des cellules CDH6-high, LTL-low, connues pour servir de progéniteurs des tubules proximaux, par rapport à la population différenciée plus mature CDH6-low, LTL-high47.

En parallèle, nous avons revisité la littérature sur les modèles de tubules proximaux 2D en examinant et en mettant en évidence les effets des cellules endothéliales et de la contrainte de cisaillement induite par le flux sur les caractéristiques et les performances des couches épithéliales matures des tubules proximaux inhibées par contact développées sur des membranes PET. Il a été établi que les HUVEC améliorent significativement l'intensité et la fréquence d'apparition des jonctions serrées, les niveaux d'ARNm d'AQP1, EpCAM, OCT2, MDR1 et SGLT2, et les taux de transport vectoriel des substrats respectifs, glucose et Rh123. Les tableaux supplémentaires 2 et 3 résument les améliorations des taux d'absorption de glucose et des taux d'efflux de Rh123 dans les systèmes de bicouche et de coculture par rapport au cas RPTEC uniquement. Contrairement aux cellules LTL +, LRP2 n'a pas été détecté (ou simplement trouvé en quantités infimes) dans les RPTEC, confirmant les études précédentes15. Cependant, la mégaline dont la quantité pouvait être modulée par le débit de perfusion était abondamment exprimée. Nous avons également démontré et mesuré les taux de transport de l'albumine. Bien que les taux obtenus ici soient bien inférieurs aux cas in vivo, il apparaît que la majeure partie du transfert de masse est entravée par la membrane.

Au meilleur de notre connaissance, aucune étude antérieure n'a incorporé de manière indépendante des cellules de tubules proximaux dérivées d'organoïdes rénaux à base de hiPSC. Personne n'a non plus tenté de construire un tissu fonctionnel 2D en co-cultivant des cellules épithéliales dérivées d'organoïdes rénaux hiPSC avec des lignées cellulaires immortalisées. D'autres ont généré et caractérisé des cellules de type tubule proximal par différenciation dirigée des CSPi, générant d'abord des cellules du mésoderme intermédiaire (IM), puis entraînant les cellules IM dans les cellules rénales15. Leur protocole de différenciation a généré un groupe de cellules ressemblant aux premiers stades du développement rénal et était stable jusqu'à 7 jours. Des marqueurs typiques tels que CDH6 et LRP2 ont été détectés exprimant des niveaux d'ARNm avec un schéma similaire exploré ici, alors qu'il n'y avait aucune trace d'ABCB1. Au contraire, nous avons détecté le gène à un faible niveau dans nos cellules LTL+. Bien qu'aucune différence majeure n'ait été observée dans le niveau d'expression de ABCB1 entre les tissus RPTEC et de coculture, le niveau et l'activité des protéines ont été significativement améliorés dans la coculture. Par conséquent, nous sommes d'accord avec et confirmons la notion selon laquelle la protéine/l'activité Pgp ne suit pas nécessairement ses niveaux d'expression génique. Dans ces travaux antérieurs, bien que la fonction Pgp ait été démontrée qualitativement en montrant l'accumulation de calcéine-AM en présence d'un inhibiteur compétitif de la Pgp, la cyclosporine A (CsA), les données de transport quantitatives telles que les taux d'efflux n'ont pas été sondées.

Nous croyons que notre système de coculture offre quelques avantages par rapport aux modèles existants de l'épithélium tubule proximal. Par exemple, il permet la modélisation de maladies spécifiques au patient, le dépistage de médicaments et l'étude de la pathogenèse, en incorporant des iPSC pertinents dérivés du patient pour former les organoïdes. Ces organoïdes peuvent ensuite être soumis à la même procédure décrite ici pour obtenir les cellules malades qui peuvent être co-cultivées avec des lignées cellulaires pour éventuellement former un tissu homogène à des fins d'analyse et de traitement. De plus, le concept de mélange de cellules obtenues à partir d'organoïdes dérivés d'iPSC avec des cellules immortalisées pour faciliter ou accélérer la sécrétion d'ECM et former un tissu fonctionnel 2D peut offrir des applications omniprésentes en ingénierie tissulaire.

Au cours des expériences de tri cellulaire, nous avons réalisé des modifications mineures dans le protocole peuvent optimiser l'efficacité de la récolte de la fraction positive en particulier. La variabilité du nombre de cellules vivantes dissociées de plusieurs organoïdes a nettement affecté le taux de réussite du MACS, mais cela pourrait être résolu en ajustant la concentration d'anticorps. Le fait que le tissu à base de semi-iPSC forme une barrière épithéliale plus rapidement que le concurrent a été démontré grâce à notre technique de mesure TEER robuste à quatre sondes. Notre choix de protocole pour générer des organoïdes rénaux n'a pas été fait au hasard. Au moment où nous avons lancé le concept d'extraction de cellules dérivées d'iPSC à partir d'organoïdes rénaux, le protocole proposé par Takasato et al.19 a généré les organoïdes rénaux dérivés de hiPSC les plus complexes. Des avancées ultérieures dans le domaine ont mis en évidence des organoïdes rénaux avec des structures néphroniques peut-être plus complexes14.

Bien que la membrane PET entrave considérablement le transport à travers la bicouche, nous avons pu quantifier les taux de transport dans diverses conditions et démontrer le transport vectoriel de l'albumine, du glucose et du Rh123 avec la capacité de moduler chacun par des inhibiteurs classiques pertinents. Une diaphonie épithélium-endothélium suffisante à travers la membrane a entraîné une amélioration de l'intégrité tissulaire (jonctions serrées), des microvillosités apicales plus denses et des niveaux d'expression génique, en particulier ceux des transporteurs, MDR1, OCT2 et SGLT2.

La principale différence entre notre méthode et les protocoles précédents6,7 est notre stratégie pour former/étudier une couche de tubule proximal épithélial déjà mature (inhibée par contact) avant d'introduire des cellules endothéliales dans l'équation. De plus, nous nous sommes abstenus d'appliquer tout revêtement ECM supplémentaire (artificiel) sur la membrane permettant aux cellules de sécréter leur propre ECM. La construction tissulaire était délibérément destinée à être façonnée à plat pour faciliter la caractérisation de la coculture et l'analyse quantitative des taux de réabsorption/filtration pertinents dans une puce microfluidique.

Les puces sont composées de deux dalles PDMS identiques et d'une membrane PET poreuse prise en sandwich entre elles (Fig. 3a supplémentaire). Des membranes en PET ayant une taille de pores et une porosité de 3, 0 μm et 5%, respectivement, ont été découpées sur des supports perméables Falcon (Corning 353091). Les dalles ont été moulées en réplique sur ¼ de tranches de Si(100) de 4" portant des motifs de canaux microfluidiques en relief formés à l'aide de la photolithographie SU-8 standard. En bref, un mélange 10:1 de PDMS (Sylgard 184, Toray Dow Corning) et d'agent de durcissement a été versé sur les moules placés dans des boîtes de Pétri. Après durcissement et détachement des dalles des moules, nous avons examiné deux méthodes pour monter et coller la membrane. la première approche, une très fine couche de PDMS non durci a été centrifugée sur la dalle inférieure pour servir de couche d'adhérence sur laquelle la membrane a été positionnée. La dalle supérieure a ensuite été placée sur la membrane et soigneusement alignée au microscope afin que les canaux microfluidiques, séparés par la membrane, se chevauchent complètement. La puce a finalement été durcie dans un four à 65 ° C pendant 1 h. De plus, une partie du PDMS non durci diffusait dans les canaux, réduisant la surface disponible de la membrane pour la culture cellulaire. Les dispositifs fabriqués de cette manière ont été utilisés pour des expériences de validation préliminaires, y compris la culture cellulaire et l'immunocoloration. Dans la deuxième méthode, aucune couche d'adhérence n'a été appliquée. En bref, la membrane et la dalle inférieure avec le côté microcanal vers le haut ont été traitées sous plasma O2 (Covance-1MP, Femto Science Inc.) pendant 1 min pour rendre les surfaces hydrophiles. La membrane a ensuite été placée sur la dalle inférieure. Ensuite, la dalle supérieure ainsi que la dalle inférieure portant la membrane ont été exposées au plasma O2 pendant 1 min. Les dalles ont été immédiatement rassemblées et collées sous microscope. De cette manière, il y avait une chance unique d'aligner les microcanaux sous microscope car les dalles de PDMS oxydées se lieraient fortement les unes aux autres après avoir été en contact. Néanmoins, comme tout le processus s'est déroulé à température ambiante, la membrane est restée parfaitement plane. Après le collage, des trous de 2 mm de large ont été percés à travers les dalles aux deux extrémités des microcanaux. En général, nous n'avons pas remarqué d'écart majeur dans les résultats mesurés qui pourrait être attribué à la légère courbure de la membrane ou à la réduction de sa surface apparente. Cependant, des dispositifs fabriqués à température ambiante ont été utilisés dans la quantification des taux de transport.

Les hiPSC ont été passés trois fois avant l'ensemencement pour la différenciation. Après décongélation, les trois passages ont été effectués dans des plaques à 6 puits. Les plaques ont d'abord été recouvertes d'iMatrix-511 (0,5 mg mL-1, Nippi, 892011/892012) à 3 μg mL-1 préparé dans 1 mL de DPBS par puits (1/6). Les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 1 h, puis remplies de 0, 75 ml (par puits) de StemFit (Ajinomoto, AK02N) contenant 10 μM d'inhibiteur ROCK (Y27632, 10 mM, Wako, 253-00511) et incubées à nouveau. Des cryotubes contenant 106 ml-1 de cellules hiPSC non marquées (fibroblastes CRL1502-C32 féminins dérivés de fibroblastes fœtaux ATCC CRL-1502) ou de hiPSC marquées (H2B-GFP-integrated 1502.3) congelées dans 200 µL de Stem Cell Banker ont été rapidement décongelées dans un bain-marie à 37 °C. Les cellules ont été soigneusement transférées dans des tubes Eppendorf de 5 ml contenant 5 ml de StemFit à l'aide de pointes de pipette à large alésage de 1 ml. Le tube a été centrifugé à 200 G pendant 5 min. Après aspiration du surnageant, les cellules ont été resuspendues dans 100 μL de StemFit et comptées. Une suspension cellulaire de 1,5 ml a été préparée dans StemFit pour chaque puits de manière à contenir 104 cellules et ajoutée à des plaques de puits recouvertes d'iMatrix. Après ensemencement, les plaques ont été maintenues à température ambiante pendant 5 min pour maintenir une couverture homogène dans tout le puits puis incubées à 37°C. Entre les passages et avant la dissociation, les cellules ont été lavées avec du DPBS (1 ml par puits) deux fois, trempées dans du TrypLE (Fisher, 12563-029) 0,3 ml, incubées pendant 5 min, agitées en tapotant une fois et incubées à nouveau pendant 3 min. Les cellules ont été collectées à partir de chaque puits dans des tubes de 5 ml en ajoutant 1 ml de StemFit et réensemencées sur des plaques de puits recouvertes d'iMatrix à 104 cellules par puits, comme décrit ci-dessus. Après trois passages, les cellules ont été dissociées et cultivées au jour -1. La différenciation a commencé le jour 0 comme indiqué dans la réf. 19. En bref, la séquence primitive postérieure a été induite en activant la protéine morphogénétique osseuse (BMP) et la signalisation canonique WNT à l'aide de l'inhibiteur de glycogène synthase kinase (GSK-3), CHIR99021, dans APEL. CHIR a été remplacé par FGF9 au jour 5 pour induire le mésoderme intermédiaire. Au jour 7, l'auto-organisation 3D a été initiée en cultivant des agrégats sur des filtres transwell. Les facteurs de croissance ont été retirés au jour 12.

Des cellules RPTEC/TERT1 immortalisées cryoconservées (ATCC® CRL-4031™) stockées à 106 cellules/flacon avec un nombre de passages inférieur à 9 ont été décongelées et sous-cultivées dans des flacons de culture cellulaire T25 jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence d'environ 90 %. Pendant la période de sous-culture qui a duré 5 jours, du DMEM/F12 (Gibco 11320033) additionné du kit de croissance RPTEC immortalisé hTERT (ATCC® ACS4007™) a été utilisé comme milieu de culture selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été trypsinisées et remises en suspension à 4 × 106 cellules/mL dans REGM™ (Lonza CC-3190). Les microcanaux à puce et les réservoirs ont été stérilisés avec de l'éthanol à 70 %, séchés sous un banc propre et exposés à la lumière UV pendant 1 h. Avant l'ensemencement, la membrane a été recouverte d'un agent d'adhésion cellulaire, FNC Coating Mix® (Athena 0407), et incubée à 37 ° C pendant 1 min pour améliorer le taux d'attachement cellulaire. Après avoir rempli le canal inférieur de chaque appareil avec 200 μL de REGM, 30 μL de la suspension cellulaire ont été doucement injectés dans le canal supérieur. Les appareils ont été incubés à 37 ° C, dans 5% de CO2 pendant 1 h jusqu'à ce que les RPTEC se déposent complètement et se fixent à la membrane, après quoi 170 μL de REGM ont été ajoutés au canal supérieur. Les dispositifs ont été maintenus dans l'incubateur et surveillés pendant que les milieux des deux canaux étaient renouvelés quotidiennement.

Sur des puces désignées pour porter la bicouche, les RFP-HUVEC ont été cultivées du côté opposé de la membrane au jour 10. Des HUVEC brièvement marquées par RFP (Angio-Proteomie Co. cAP-0001RFP) stockées à 5 × 105 cellules/flacon avec un nombre de passages inférieur à 4 ont été sous-cultivées dans EGM2™ (Lonza CC-3162) de la même manière que les RPTEC. À la confluence (∼90%), les cellules ont été remises en suspension à 4 × 106 cellules/mL dans EGM2. Après aspiration de REGM, 30 μL de la suspension HUVEC ont été doucement injectés dans le canal inférieur de chaque appareil. Les dispositifs ont été retournés immédiatement et incubés pendant 2 h jusqu'à ce que les cellules endothéliales se fixent correctement. Les appareils ont ensuite été retournés et 170 μL d'EGM2 ont été ajoutés au canal inférieur. Par la suite, REGM et EGM2 ont été remplacés tous les jours.

Nous avons conçu une configuration de système de culture de perfusion sur mesure pour fonctionner à 37 ° C, 5 % de CO2 et capable de gérer six appareils simultanément. À partir du jour 11/jour 1 de la culture RPTEC/HUVEC, REGM et EGM2 provenant de bocaux en verre stérilisés contenant 3 mL de chacun ont été perfusés à la fois à 10 μL min–1 ou 1 μL min–1 à travers les microcanaux correspondants pour imiter les conditions de culture dans des milieux statiques et fluides, respectivement. À un débit de Q = 10 μL min–1, la contrainte de cisaillement exercée sur la membrane apicale des cellules épithéliales, τ, a été estimée à 0,06 dyn cm−2 en utilisant

où η = 0,7 est la viscosité moyenne approximative à 37 ° C, et h = 0,35 mm et W = 1,0 mm sont respectivement la hauteur et la largeur du canal. L'ensemble du support dans les bocaux était remplacé tous les deux jours.

Les cellules de chaque côté de la membrane ont été fixées en appliquant 4 % de paraformaldéhyde dans du DPBS (1X) (Gibco®) dans les deux canaux pendant 10 min, perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 pendant 10 min sauf indication contraire, puis trempées dans un tampon de blocage de 10 % de sérum d'âne pendant 1 h, le tout à température ambiante. Des mélanges d'anticorps primaires préparés dans le tampon de blocage ont été appliqués dans les deux microcanaux et les échantillons ont été laissés à 4 ° C pendant la nuit. Le jour suivant, les membranes ont été abondamment rincées avec du DPBS trois fois 30 min chacune, puis trempées dans le mélange d'anticorps secondaires, préparés dans du DPBS, pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont ensuite été traitées avec du DAPI pendant 10 min, suivies d'un agent de montage antifade (Fisher, S36937) et montées sur des lames de microscope. La microscopie confocale à fluorescence a été réalisée avec un microscope Olympus FV3000. Les images ont été analysées par le logiciel de visualisation FV31S-SW (v2.5.1.228, Olympus) et Image J (v1.53f51, NIH, USA). Le tableau supplémentaire 4 répertorie les concentrations d'anticorps utilisées.

Les membranes chargées de cellules dans les puces ont d'abord été rincées avec du DPBS, fixées pendant une nuit à 4 ° C avec un tampon composé de 2% de glutaraldéhyde (qualité EM, Electron Microscopy Science) et de 0, 1 M de NaPO4 dans de l'eau, puis post-fixées dans 2% OsO4 (Crystal, Heraeus Chemicals, Afrique du Sud) pendant 3 h dans un bain de glace. Les puces ont été sous-traitées pour la microscopie. À leur arrivée à l'installation, les spécimens ont été déshydratés dans de l'éthanol gradué (50, 70, 90, 100, 100 et 100 %, chacun pendant 15 min) et noyés dans des résines époxy. Des sections ultrafines de 80 nm ont été coupées par la technique de l'ultramicrotome. Des sections ultrafines colorées avec de l'acétate d'uranyle pendant 10 min et une solution de coloration au plomb pendant 5 min ont été analysées sur un HITACHI H-7600 à 100KV.

L'ARNm total a été extrait et purifié à partir de 3 échantillons individuels par condition à l'aide du kit d'isolement d'ARN (NucleoSpin® RNA). Nous avons utilisé une quantité maximale de 3 μg/60 μL d'ARNm pour la transcription inverse avec le kit PrimeScript™ RT Master Mix conformément aux instructions du fabricant. Les échantillons d'ADNc de matrice ont été dilués (1:10) dans le TaqMan® Universal PCR Master Mix et les amorces sens et antisens du TaqMan® Gene Expression Assay par gène d'intérêt et distribués dans 5 puits d'une plaque de réaction multipuits de 384 puits. La RT-PCR quantitative a été réalisée à l'aide du système de détection PCR en temps réel QuantStudio® 5 (ThermoFisher Scientific). La β-actine a été utilisée comme gène endogène. Les données d'amorce sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 5.

30 organoïdes rénaux (KO) ont été préparés selon le protocole de Takasato et al. (2016). Les organoïdes ont été récoltés à J22 d'induction et dissociés à l'aide des enzymes fournies dans le Tumor Dissociation Kit (Miltenyi Biotec, #130-095-929) selon les instructions du fabricant. Les triples enzymes, H, R et A, telles que préparées, ont été dissoutes dans un tampon de séparation à des concentrations de 4, 2 et 0,5 % (v/v), respectivement. Le tampon de séparation était composé de DPBS, EDTA (Fisher, 15575020) à 2 mM et FBS à 0,5 % (v/v). Les cellules dissociées ont été mises en suspension dans le même tampon tout au long des processus de séparation et de tri jusqu'à l'étape d'ensemencement. Le tri a été effectué à l'aide d'un trieur de cellules BD FACSAria™ III et les cellules triées ont été remises en suspension dans du REGM contenant 10 μM d'inhibiteur de ROCK (Fuji Film, CultureSure® Y-27632) pour l'ensemencement ou l'isolement de l'ARNm. Voir les Fig. 1 et 2 supplémentaires pour plus de détails.

Pour chaque expérience 16 KO ont été préparés. Les organoïdes ont été récoltés entre J22-26 d'induction, dissociés de la même manière que dans FACS, suspendus dans le tampon de séparation et conservés sur glace tout au long du processus avant le tri. Les échantillons ont été brièvement centrifugés, remis en suspension et divisés en deux portions égales (8 KO par portion). Chaque portion a été passée à travers un tamis pluriStrainer® de 10 µm (pluriSelect, #43-50010-03) pour éliminer tous les amas de cellules restants. Les portions tamisées ont été remélangées, centrifugées, remises en suspension dans un tampon de séparation et comptées. La lectine de tétragonolobus de lotus biotinylée (LTL), un marqueur de bordure en brosse robuste pour les tubules proximaux, a été appliquée à la suspension à un rapport de 1: 100 en tant qu'anticorps primaire. Après incubation pendant 30 min à 4 °C, l'échantillon a été centrifugé et remis en suspension deux fois pour éliminer complètement tout anticorps non attaché. Des microbilles monoclonales anti-biotine (Miltenyi Biotec, #130-105-637) ont été appliquées dans un rapport de 1:5 pour un marquage magnétique indirect. La suspension a ensuite été incubée à 4°C pendant 30 min, centrifugée et remise en suspension dans un tampon de séparation (500 μL). La suspension a été doucement appliquée sur une colonne MS (Miltenyi Biotec, #130-042-201) branchée dans l'une des huit fentes d'un séparateur OctoMACS (Miltenyi Biotec, #130-042-108). Avant d'appliquer la suspension, un filtre de pré-séparation de 30 µm (Miltenyi Biotec, #130-041-407) a été placé sur la colonne pour éliminer tous les amas qui obstrueraient autrement les pores et le pilier entier a été humidifié avec 500 µL de DPBS. Une fois la suspension appliquée, la colonne a été rincée deux fois avec 500 µL de tampon de séparation pour épuiser complètement la fraction négative (LTL–) (volume total 1,5 mL). Pour collecter la fraction positive (LTL+), la colonne a été retirée du séparateur, placée sur un tube de collecte et immédiatement rincée avec 1 ml de tampon de séparation. Le taux de réussite MACS fait référence à la somme du produit MACS final (cellules LTL+ et LTL–) divisée par le nombre total de cellules vivantes filtrées (< 10 μm) qui ont été soumises au marqueur LTL, aux microbilles, puis appliquées aux colonnes de séparation. Évidemment, 50% des cellules ont été perdues lors du marquage avec des anticorps. Au cours d'expériences d'optimisation, nous avions établi qu'en diminuant la concertation d'anticorps LTL dans la suspension cellulaire de 1:50 à 1:100 la spécificité augmenterait de 7%. Les graphiques de la figure 1c montrent les populations relatives des produits MACS finaux en fonction de la concentration d'anticorps LTL. Le tableau supplémentaire 1 montre les statistiques du processus MACS. Les données sont recueillies à partir de sept expériences consécutives. Enfin, les deux fractions ont été remises en suspension dans du REGM contenant 10 μM d'inhibiteur de ROCK pour l'ensemencement ou l'isolement de l'ARNm.

Des aliquotes de petit volume de BSA conjugué AF488 (ThermoFisher, A13100) ont été préparées à 5 mg mL–1 et conservées à -30 °C jusqu'à utilisation. En utilisant notre système de perfusion maison, quelle que soit la configuration tissulaire (monocouche ou bicouche), nous avons fait circuler 3 ml de REGM contenant 50 μg ml-1 de BSA conjugué AF488 (ThermoFisher, A13100) et EGM2 vierge à travers les canaux supérieur et inférieur, respectivement. Les milieux ont été perfusés et mis en circulation pendant 24 h. Des échantillons de 10 μL ont été prélevés dans le réservoir contenant l'EGM2 alimentant le canal inférieur à des intervalles de 6 h. Les concentrations de diffusat dans l'EGM2 ont été mesurées immédiatement à l'aide d'un spectrophotomètre (NanoDrop™ 3300). Il a été supposé que retirer des volumes de 10 μL 4 fois d'une source de 3 mL ne perturbe pas l'équilibre de diffusion. Nous avons établi que la circulation des médias dans les canaux concentrés et dilués est nécessaire pour maintenir un gradient de concentration d'albumine suffisant. En raison de son poids moléculaire élevé (66 kDa), seule une infime quantité de BSA pourrait diffuser dans le cas statique (tableau supplémentaire 6). Le transfert inverse basal à apical a été quantifié de la même manière, mais à la place, la BSA conjuguée à l'AF488 a été dissoute dans l'EGM2 alimentant le canal inférieur et mesurée dans le REGM vierge au sommet. Pour évaluer l'effet inhibiteur de l'abaissement de la température sur la réabsorption de l'albumine, la configuration a été placée dans une chambre noire à 4 ° C au lieu de l'incubateur.

Des solutions mères de 2-NBD-Glucose, sonde d'absorption de glucose fluorescente (2-NBDG, Abcam, ab1462002) ont été préparées à 30 mM et conservées à –30 °C pour une utilisation ultérieure. Après rinçage du support, 200 μL de DPBS+ (Gibco, 14040133) ont été appliqués sur les canaux supérieur et inférieur, puis les dispositifs ont été trempés à 37 °C pendant 30 min. La mesure de la réabsorption du glucose a commencé en remplaçant 100 μL de DPBS+ au niveau du canal supérieur par le même volume de solution de 2-NBDG 1 mM pour atteindre une concentration finale de 0,5 mM. À des intervalles de 1 h, le diffusat au niveau du canal inférieur a été mélangé doucement, mais soigneusement, en faisant circuler manuellement (pipetage) un volume de 100 μL deux fois. La même quantité a été prélevée et stockée dans des tubes Eppendorf sombres. Le tampon appauvri a été reconstitué immédiatement en ajoutant 100 μL de DPBS+ frais. Les concentrations d'échantillons ont été mesurées entre les intervalles d'échantillonnage par NanoDrop™ 3300. Nous avons calculé la concentration temporelle de glucose à partir de la concentration des échantillons prélevés à chaque intervalle en reflétant la quantité éliminée, en utilisant l'équation suivante :

où Ct et Ct–1 représentent les concentrations réelles de 2-NDBG dans le canal aux points de temps d'échantillonnage actuels et précédents, respectivement, et Rt et Rt – 1 sont les concentrations d'échantillon correspondantes, toutes en nmol min–1. Les volumes 200 μL et 100 μL se réfèrent respectivement aux volumes totaux du canal et d'échantillonnage. Les taux ont été obtenus en effectuant une régression linéaire sur les données de concentration au cours du temps sur 0 ≤ t ≤ 3 h. L'inhibition du SGLT a été évaluée par l'administration de phloridzine. Des aliquotes de phloridzine (P3449, Sigma) ont été préparées dans de l'éthanol à 70 % à 100 mM et conservées à -30 °C pour une utilisation ultérieure. Le médicament a été appliqué à une concentration de 1000 μM (dilution 100x). L'exocytose vectorielle du glucose a été examinée en quantifiant les taux de transfert de masse dans le sens inverse, c'est-à-dire de basal à apical. Dans ce cas, le 2-NBDG a été appliqué au canal inférieur et mesuré au sommet.

Nous avons examiné les performances de la pompe à efflux Pgp en mesurant le taux de transfert de Rh123 (Fisher, R302) appliqué à 2,5 μM. Pour inhiber l'efflux de Rh123, nous avons ajouté du vérapamil en tant que candidat Rh123 à 300 μM. Après avoir retiré et rincé les milieux de culture, les canaux supérieur et inférieur ont été remplis avec 200 μL de HBSS pH 6 et HBSS pH 7,4, respectivement. Les dispositifs ont été préincubés à 37°C pendant 30 min. L'échantillonnage a été effectué d'une manière similaire à la procédure de mesure de la réabsorption du glucose. Cependant, étant donné que le taux d'efflux (basal à apical) était souhaité, le substrat a été principalement appliqué au canal inférieur et mesuré au sommet. En bref, pour maintenir une concentration source de 2, 5 μM, 100 μL du tampon du canal inférieur ont été remplacés par une solution à 5 μM de Rh123 préparée dans du HBSS pH 7, 4, avec ou sans vérapamil. Des échantillons de 100 μL ont été prélevés à intervalles réguliers dans le canal supérieur et transférés dans des puits individuels d'une plaque à 96 puits à fond noir (Corning, CLS3925). Chaque puits a été pré-rempli de HBSS pour atteindre un volume de travail de 200 μL comme suggéré par le fabricant du lecteur de microplaques. Le canal supérieur a été complété avec 100 μL de HBSS pH 6 immédiatement après le prélèvement. Avant l'échantillonnage, une seule rangée de la plaque à 96 puits a été remplie de solutions de Rh123 de concentrations connues pour obtenir des données d'étalonnage. L'émission de fluorescence des échantillons a été mesurée par un lecteur de microplaques (Molecular Devices, SpectraMax® iD5). Pour quantifier les taux de transfert dans le sens inverse, Rh123 (avec ou sans vérapamil) a été dissous dans HPSS pH 6 et administré à partir du canal supérieur.

Les données d'étalonnage de tous les substrats fluorescents sont présentées dans le tableau supplémentaire 7.

Pour les expériences d'absorption de bromure d'éthidium (EtBr), les échantillons témoins se composaient uniquement de monocouches HUVEC cultivées sur la couche supérieure. De manière similaire au test Rh123, tous les échantillons ont été préincubés dans des tampons HBSS acides et neutres. En tant que sondes fluorescentes cationiques, nous avons introduit 2,5 μM d'EtBr dans le canal inférieur (côté basal pour les RPTEC) ou 2,5 μM de 4-Di-1-ASP (ASP+) dans les côtés apical et basal, séparément. Après introduction des sondes, les dispositifs ont été incubés pendant 4 h. Les monocouches RPTEC et HUVEC ont ensuite été imagées à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé à des intervalles de 60 min et 30 min pour les expériences EtBr et ASP +, respectivement. Nous avons administré simultanément 1 mM de cimétidine en tant qu'inhibiteur d'OCT2 pour vérifier l'absorption dépendante du transporteur d'EtBr et d'ASP+. Les intensités de fluorescence relatives des échantillons ont été calculées à partir d'instantanés individuels à l'aide du logiciel Image J et normalisées à celles de l'inhibiteur RPTEC w/o.

Les mesures ont été effectuées dans des puces microfluidiques à l'aide d'une configuration à quatre sondes sur mesure28. En bref, un mélange de cellules RPTEC ou RPTEC/LTL+ a été cultivé sur la couche supérieure de la membrane comme décrit précédemment. L'impédance des membranes chargées de cellules a été mesurée à l'aide d'un compteur LCR (ZM2731, NF Co.) avec un stimulus sinusoïdal sur une plage de fréquences de 100 Hz à 10 kHz sous une tension crête à crête de 20 mV. L'impédance de base a été enregistrée avant l'ensemencement, avec les deux canaux remplis de REGM. Les valeurs TEER ont été obtenues en soustrayant la résistance de base des résistances mesurées. Toutes les mesures ont été effectuées dans un incubateur à 37°C, 5% CO2. La technique à quatre sondes permet d'éliminer les résistances série du milieu de culture et de la double couche électrique à la surface des électrodes. Nous avons appliqué un filtre passe-bas à transformée de Fourier rapide (FFT) pour lisser les courbes TEER avec une fréquence de coupure de

avec des points de valeur de fenêtre de n = 6 et un intervalle de temps de Δt = 0,5 jour.

En général, un total de N = 3 dispositifs indépendants (puces) par condition ont été utilisés pour collecter les données de mesure (taux de transport, etc.), sauf indication contraire. Pour examiner la signification entre deux groupes de données, un test t à deux échantillons a été effectué avec un seuil de signification fixé à 0,05. Nous avons exclu l'analyse de signification statistique sur les données qPCR de la Fig. 4a car il n'y avait que N = 2 expériences indépendantes pour les cas RPTEC et LTL+. Les données qPCR présentées dans les informations supplémentaires (c'est-à-dire les figures supplémentaires 1d, 2b) sont collectées à partir d'une expérience par condition avec n = 5 répétitions techniques. Par conséquent, aucune analyse statistique n'a été effectuée entre les groupes. D'autres détails sont expliqués dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources numériques pour les graphiques et les diagrammes sont stockées sur https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22339615.v2.

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Les auteurs remercient l'Institut de recherche Hanaichi UltraStructure pour l'assistance à la microscopie TEM. Nous tenons également à remercier Mayumi Moriwake, Yoshikazu Kameda, Shiho Morimoto et Aki Kubo pour leur aide dans la maintenance des organoïdes rénaux, la transcription inverse, la qPCR et les expériences de microfabrication. Remerciements particuliers à Yoshiki Sahara pour son aide dans le développement du protocole MACS. Ce travail a été partiellement soutenu par le Center of Innovation Program (COI) de MEXT et JST (subvention n° JPMJCE1307), le projet AMED-MPS (subventions n° JP22be1004204 et JP17be0304205) et le Kyoto University Nanotechnology Hub dans le cadre du "Nanotechnology Platform Program" parrainé par le ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (MEXT), Japon, (subvention n° JPMXP09F19K T0107).

Département de micro-ingénierie, Université de Kyoto, Kyoto, 615-8540, Japon

Ramin Banan Sadeghian, Ryohei Ueno, Yuji Takata, Akihiko Kawakami, Cheng Ma et Ryuji Yokokawa

Centre de recherche et d'application sur les cellules iPS (CiRA), Université de Kyoto, Kyoto, 606-8507, Japon

Toshikazu Araoka

RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research (BDR), Kobe, 650-0047, Japon

Minoru Takasato

École supérieure de médecine, Université d'Osaka, Osaka, 565-0871, Japon

Minoru Takasato

Graduate School of Biostudies, Université de Kyoto, Kyoto, 606-8501, Japon

Minoru Takasato

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RBS et RY ont conçu et supervisé le projet, interprété les données et rédigé le manuscrit. RBS a établi les protocoles pour la culture/maintenance cellulaire, l'immunomarquage, la microscopie confocale, l'analyse d'images, le profilage d'intensité z, la mesure TEER, la qPCR, les tests de transport de glucose et d'albumine, la microfabrication de puces, et a réalisé les expériences et analysé les données. RU a conçu les tests de transport Pgp et OCT2, conduit la culture cellulaire et effectué les mesures correspondantes sur le système bicouche RPTEC/HUVEC. YT et RU ont conçu et mené des expériences TEER. KA a exécuté le test du transporteur Pgp sur le système de coculture RPTEC/LTL +. CM a conçu le modèle d'éléments finis pour la puce utilisée pour modéliser la contrainte de cisaillement induite par l'écoulement et a exécuté la simulation. MT a fourni les protocoles de culture et de maintenance des KO dérivés de hiPSC, MACS, et a aidé à l'interprétation des données. TA a fourni le protocole pour le FACS et a participé aux expériences de tri pertinentes et à l'analyse des données. Tous les auteurs ont lu, édité et commenté le manuscrit.

Correspondance avec Ryuji Yokokawa.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Roberto Gramignoli et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Simona Chera, Eve Rogers et George Inglis.

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Réimpressions et autorisations

Banan Sadeghian, R., Ueno, R., Takata, Y. et al. Les cellules triées des organoïdes rénaux dérivés de hiPSC couplées à des cellules immortalisées modélisent de manière fiable le tubule proximal. Commun Biol 6, 483 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04862-7

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Reçu : 19 septembre 2022

Accepté : 21 avril 2023

Publié: 04 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04862-7

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