Bio-impression 3D à partir d'une nouvelle photo

npj Regenerative Medicine volume 8, Article number: 18 (2023) Citer cet article

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La bio-impression tridimensionnelle (3D) est une technique très efficace pour fabriquer des constructions chargées de cellules en ingénierie tissulaire. Cependant, la polyvalence de la fabrication d'hydrogels chargés de cellules précises et complexes est limitée en raison de la faible capacité de réticulation des hydrogels contenant des cellules. Ici, nous proposons un processus de bio-impression assistée par fibre optique (OAB) pour réticuler efficacement les hydrogels méthacrylés. En sélectionnant les conditions de traitement appropriées pour la technique de photo-réticulation, nous avons fabriqué des structures chargées de cellules biofonctionnelles, notamment de la gélatine méthacrylée (Gelma), du collagène et une matrice extracellulaire décellularisée. Pour appliquer la méthode à la régénération des muscles squelettiques, des constructions Gelma chargées de cellules ont été traitées avec une buse fonctionnelle ayant un repère topographique et un processus OAB qui pourrait induire un alignement uniaxial de C2C12 et de cellules souches adipeuses humaines (hASC). Des degrés significativement plus élevés d'alignement cellulaire et d'activités myogéniques dans la structure Gelma chargée de cellules ont été observés par rapport à ceux de la construction cellulaire imprimée à l'aide d'une méthode de réticulation conventionnelle. De plus, un potentiel de régénération in vivo a été observé dans les défauts musculaires volumétriques dans un modèle murin. La construction chargée de hASC a significativement induit une plus grande régénération musculaire que la construction cellulaire sans repères topographiques. Sur la base des résultats, le processus de bioimpression nouvellement conçu peut s'avérer très efficace dans la fabrication de constructions chargées de cellules biofonctionnelles pour diverses applications d'ingénierie tissulaire.

Récemment, des échafaudages chargés de cellules imitant des structures tissulaires complexes naturelles ont été fabriqués à l'aide de diverses méthodes ascendantes, telles que les processus de bioimpression électrohydrodynamique, microfluidique, photo ou soft-lithographique et tridimensionnelle (3D)1,2,3,4,5. En raison de la capacité de production efficace démontrée par les techniques multicouches, le processus de bioimpression 3D a été largement adopté dans les applications d'ingénierie tissulaire. En particulier, les applications polyvalentes de diverses bio-encres ont été considérablement explorées6,7,8,9.

Auparavant, de nombreux résultats prometteurs ont été obtenus dans le développement de muscles squelettiques issus de l'ingénierie tissulaire avec des fonctionnalités améliorées sans bioprinting10,11. Cependant, un inconvénient notable des constructions de muscle squelettique issues de l'ingénierie tissulaire sans bio-impression est l'incapacité de fabriquer des géométries spécifiques au patient. Pour surmonter ce problème, divers paramètres, notamment la température d'impression, la pression pneumatique, la vitesse d'impression et le processus de réticulation pour fabriquer des constructions cellulaires 3D avec des activités biologiques appropriées, telles que la viabilité/prolifération cellulaire élevée et la différenciation/maturation phénotypique des cellules imprimées doivent être pris en compte.

Cependant, les procédés d'extrusion à base de buses présentent plusieurs lacunes, telles qu'une résolution limitée de la taille des entretoises, une densité cellulaire restreinte des entretoises chargées de cellules et une faible imprimabilité, résultant de la faible nature mécanique des hydrogels à chargement cellulaire. Plusieurs bioinks avancés conjugués à des ions ont été introduits pour obtenir des constructions cellulaires ; cependant, la fabrication de structures chargées de cellules mécaniquement stables à l'aide de la technologie d'impression 3D reste un défi à surmonter dans la technique d'impression et le processus de formation de bioink8,12,13.

Récemment, pour pallier les lacunes des entretoises chargées de cellules obtenues à l'aide d'un procédé d'impression 3D, plusieurs stratégies de réticulation, y compris des procédés de photo-réticulation in situ combinés à l'impression, ont été proposées8,14,15. Par exemple, la fabrication de filaments chargés de cellules à micro-échelle mécaniquement stables nécessite des processus d'impression pour utiliser un système de buse à noyau / coque, dans lequel la bio-encre d'alginate dans la région de la coque est immédiatement réticulée avec une solution de chlorure de calcium qui protège la gélatine méthacrylée chargée de cellules photo-réticulée (Gelma) dans le noyau16,17. De plus, des études similaires ont fabriqué des fibres à noyau chargé de cellules (Gelma)/enveloppe (alginate de sodium) à l'aide d'un canal microfluidique dans lequel Gelma chargé de cellules endothéliales dans le noyau est conçu18. De plus, une méthode de réticulation in situ utilisant une buse coaxiale capillaire transparente connectée à une imprimante 3D a été introduite pour obtenir des structures imprimées stables (réseaux microscopiques et tubes creux) sans dépendre de la viscosité de la bioencre8.

Les procédés d'impression proposés ont clairement démontré des résultats avancés dans l'obtention de structures microfibreuses 3D chargées de cellules qui imitent les morphologies intrinsèques et les biofonctions de vrais tissus fibreux ; cependant, les méthodes utilisent une bioencre limitée (c'est-à-dire l'utilisation d'alginate réticulable rapide dans des ions calcium) pour soutenir les matériaux bioactifs chargés de cellules. En outre, pour les systèmes photoréticulables in situ, une structure 3D multicouche réaliste ne peut pas être facilement obtenue en raison de la région de coque à peine photoréticulée des hydrogels chargés de cellules méthacrylées en circulation, et une buse spécifiquement transparente et hydrophobe est nécessaire.

Pour relever ces défis rencontrés par les systèmes d'impression précédents, nous présentons une nouvelle stratégie de photo-réticulation combinée à un processus d'impression pour fabriquer des structures mécaniquement stables et des structures chargées de cellules multicouches réalistes. À cette fin, nous avons utilisé une fibre optique intégrée dans une buse d'impression générale pour photo-réticuler de manière stable des hydrogels méthacrylés fluides (gélatine méthacrylée, collagène et matrice extracellulaire décellularisée (dECM)). En utilisant ce système de réticulation unique, des entretoises chargées de cellules mécaniquement stables et biologiquement sûres et une structure chargée de cellules 3D multicouche construite avec une force d'adhérence raisonnable entre les filaments chargés de cellules ont été efficacement fabriquées. Pour appliquer la polyvalence du processus de photo-réticulation, des entretoises chargées de cellules à micro-motifs de surface, utilisant du C2C12 et des cellules souches adipeuses humaines (hASC) traitées avec une buse en plastique rainurée en surface, ont été fabriquées pour la régénération des tissus musculaires. Les constructions cellulaires avec un motif de surface rainuré uniaxialement ont démontré une différenciation myogénique améliorée en raison de l'alignement cellulaire obtenu par la combinaison de la surface rainurée dans la buse et du processus de réticulation assisté par fibre optique in situ. De plus, les constructions hASC bio-imprimées ont été appliquées dans une lésion de défaut musculaire volumétrique chez la souris, et elles ont démontré une régénération musculaire considérablement améliorée par rapport à celles fabriquées à l'aide d'un processus de bio-impression conventionnel.

En général, les bio-encres photo-réticulables, telles que les hydrogels méthacrylés à base de gélatine, de collagène, d'acide hyaluronique et de matrice extracellulaire décellularisée, ont été largement utilisées dans la fabrication de constructions chargées de cellules en raison de leurs capacités exceptionnelles d'encapsulation cellulaire et de leurs propriétés mécaniques contrôlables qui peuvent être efficacement obtenues à l'aide de divers processus de photo-réticulation9,19,20,21,22. Lorsque des bioencres photoréticulables sont combinées à un processus général de bioimpression, des constructions multicouches chargées de cellules avec des géométries de pores personnalisables peuvent être fabriquées avec succès. Cependant, la formation précise et stable de constructions cellulaires fabriquées à l'aide de la bio-impression complétée par un processus de photo-réticulation dépend de manière critique de l'approche de réticulation utilisée. Parmi les différentes stratégies de réticulation combinées à la bio-impression, la stratégie la plus révolutionnaire est la "méthode de photo-réticulation in situ" exécutée à l'aide d'une buse en silicone hydrophobe transparente, qui peut réduire la contrainte de cisaillement d'une bioencre photo-réticulée fluide8. Lorsque la bio-encre passe à travers la buse, la lumière UV peut être directement exposée à la buse transparente pour réticuler la bio-encre fluide photo-réticulable et à faible viscosité. Cette méthode est d'une immense importance en ce qu'elle réticule efficacement et de manière stable les bio-encres à faible viscosité pour atteindre des entretoises chargées de cellules mécaniquement stables. Cependant, le processus de photo-réticulation in situ nécessite une buse photo-perméable transparente et hydrophobe spécialement conçue. En outre, étant donné que la surface des entretoises chargées de cellules peut être réticulée plus activement que la région centrale des entretoises imprimées, la propriété adhésive entre les entretoises peut être relativement médiocre après la fabrication de structures cellulaires 3D, ce qui entraîne une faible capacité de forme structurelle 3D.

Pour surmonter les lacunes de la réticulation in situ des bioencres photoréticulables, nous avons développé une nouvelle méthode de réticulation utilisant un processus de bioimpression 3D assistée par fibre optique (OAB) qui était complètement différent d'une bioimpression conventionnelle (CB) utilisant un processus de réticulation in situ (Fig. 1a – c). Pour évaluer les performances du processus OAB, nous avons sélectionné une bioencre photo-réticulable à base de Gelma chargée de myoblastes C2C12 avec une densité de 1 × 107 cellules/mL. En effet, Gelma peut être considérée comme une bioencre photoréticulable typique avec des propriétés biocompatibles et biodégradables, et elle peut être largement appliquée dans les échafaudages d'ingénierie tissulaire, les systèmes d'administration de médicaments et les substrats de cicatrisation des régions de plaies23,24,25. Pour réticuler efficacement la bio-encre, une fibre optique a été intégrée dans une buse d'impression générale et, en contrôlant l'intensité d'une source de lumière UV (tête de point UV, illustrée à la Fig. 1d), nous avons pu obtenir une construction chargée de cellules 3D mécaniquement stable et biologiquement sûre, comme présenté dans les images optiques et vivantes (vertes) / mortes (rouges) de la Fig. 1a et l'image optique de la structure maillée Gelma imprimée (Fig. 1c). La figure 1a, c présente une image optique de la lumière UV telle qu'observée à travers la fibre optique insérée dans la buse. De plus, pour éviter une élévation de la température de la bio-encre par la fibre optique, une chemise d'eau de refroidissement (4 ° C) a été placée autour de la buse d'impression (Fig. 1c, d). Par rapport à la post-réticulation conventionnelle, le processus OAB proposé peut obtenir des structures 3D chargées de cellules avec des morphologies intrinsèques, comme le démontrent les valeurs de circularité améliorées (Fig. 1 supplémentaire). De plus, la méthode OAB peut fabriquer une structure 3D multicouche réaliste contrairement au CB, grâce à une meilleure adhérence entre les entretoises.

un schéma d'un processus de bioimpression assistée par optique (OAB) utilisant une fibre optique placée dans une buse d'une imprimante, et des images optiques et vivantes (vertes)/mortes (rouges) de la jambe de force Gelma chargée de C2C12 imprimée. b Schémas d'un hydrogel photo-réticulé dans une buse traitée avec les procédés OAB et CB. c, d Système OAB connecté à une chemise de refroidissement par eau, une image de buse d'impression en coupe transversale et une image optique d'une structure Gelma chargée de cellules à mailles imprimées.

Pour observer l'effet du processus OAB sur la capacité de photo-réticulation de la bioencre Gelma, 5% en poids de Gelma a été utilisé. La figure 2a illustre le module de stockage (G′) de la Gelma bioink en mode balayage temporel avant et après exposition aux UV (dose UV = 120 mJ/cm2 pendant 10 s). Comme prévu, la rigidité de Gelma exposée à la lumière UV a été significativement améliorée après exposition aux UV.

a Module de stockage (G′) de 5% en poids de Gelma obtenu à partir de tests de balayage temporel effectués avant et après l'exposition aux UV (dose UV = 120 mJ/cm2 pendant 10 s). b Changement de couleur dans le mélange de 5% en poids de Gelma et de rouge de phénol à différentes doses d'UV. c Images optiques en coupe transversale des entretoises imprimées Gelma / phénol-rouge fabriquées à l'aide de procédés conventionnels de bioimpression (CB) et OAB, la distribution de la valeur de gris à l'aide des images en coupe transversale pour le rayon et la différence de valeur de gris au centre et régions de bord. d Images optiques de structures de maillage Gelma imprimées après impression in situ, pendant l'agitation et après agitation pour illustrer la stabilité structurelle. e Test de cisaillement des structures de treillis imprimés traitées avec CB et OAB pour observer les propriétés adhésives entre les entretoises. f Courbes contrainte-déformation en traction et module de Young des structures imprimées de Gelma. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Les valeurs p ont été calculées par le test t de Student (n = 3/groupe ; *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001). Barre d'échelle, 200 µm (c) ; 1 mm (d).

Pour observer l'effet de la photo-réticulation produite par la fibre optique placée à l'intérieur de la buse sur la distribution de la réticulation sur la section transversale d'une entretoise Gelma, nous avons mesuré la distribution de l'intensité de la couleur rouge du phénol-rouge, qui différait selon le degré de photo-réticulation. La figure 2b illustre les différentes intensités de couleur rouge pour le mélange de 5% en poids de Gelma/phénol-rouge (150 mg/L) à différentes doses UV (0, 60 et 120 mJ/cm2), indiquant que la couleur rouge s'est estompée en blanc à une dose UV croissante. La figure 2c illustre deux images en coupe transversale d'entretoises Gelma qui ont été réticulées à l'aide des processus CB et OAB, respectivement. Dans les procédés d'impression/réticulation, la taille de la buse d'impression, la vitesse de la buse, la pression pneumatique et la dose d'UV étaient respectivement de 700 μm, 1 mm/s, 120 ± 10 kPa et 120 mJ/cm2.

La distribution de la couleur rouge pour les entretoises de gélatine photo-réticulée fabriquées à l'aide des méthodes CB et OAB est illustrée à la Fig. 2c. Comme indiqué dans les résultats, la distribution transversale de la couleur grise illustrant le degré de photo-réticulation était différente pour chaque méthode. Pour le procédé CB, la distribution relative des couleurs grises dans la région de la section transversale de la jambe Gelma était similaire au rayon, tandis que pour la jambe Gelma traitée avec l'OAB, la photoréticulation était relativement plus élevée dans la région centrale que dans la région de la coque (le graphique de la différence de valeur de gris sur la Fig. 2c). D'après ces résultats, nous pouvons nous attendre à ce que le degré relativement faible de réticulation dans la région de la coque de la jambe de force puisse affecter la formation structurelle 3D des filaments imprimés multicouches. La figure 2d illustre des structures de maillage imprimées fabriquées à l'aide des procédés CB et OAB (5 % en poids de Gelma, dose UV = 120 mJ/cm2, taille de la buse = 700 μm, vitesse de déplacement de la buse = 2 mm/s et pression pneumatique = 120 ± 10 kPa). Après avoir fabriqué les structures Gelma, les structures imprimées ont été secouées. Comme le montrent les images optiques, la structure de maillage 3D a été détruite dans les entretoises Gelma fabriquées à l'aide du procédé CB, tandis que la structure de maillage Gelma fabriquée à l'aide du procédé OAB a été maintenue de manière stable dans sa forme initialement conçue. Ce résultat indique que les entretoises de gélatine imprimées à l'aide du procédé OAB adhéraient bien les unes aux autres pour maintenir la forme structurelle 3D.

Pour évaluer la force d'adhérence entre les entretoises Gelma, nous avons mesuré le déplacement en fonction de la charge pour les tests de cisaillement (Fig. 2e). Par conséquent, l'énergie adhésive entre les entretoises Gelma et la charge maximale de la force interfaciale entre les entretoises Gelma fabriquées à l'aide du procédé OAB étaient significativement plus élevées que celles des entretoises Gelma traitées à l'aide du procédé CB. Cela indique que les formations structurelles 3D constituées d'entretoises multicouches imprimées avec le procédé OAB peuvent être obtenues beaucoup plus efficacement que celles imprimées avec le procédé CB. Cependant, pour les courbes contrainte-déformation en traction, la structure traitée avec CB présentait un module de Young significativement plus élevé que la structure imprimée avec OAB (Fig. 2f). Nous pensons que la différence de module de traction pourrait provenir des différents degrés d'homogénéité de réticulation dans les entretoises, comme le montre la figure 2c. Pour les entretoises Gelma réticulées avec le procédé OAB, la contrainte de traction appliquée de l'extérieur pourrait être fortement concentrée sur la région réticulée relativement faible des entretoises, induisant une résistance inférieure de la force de traction par rapport à celle des entretoises Gelma réticulées de manière homogène traitées avec CB.

Pour déterminer la plage appropriée de paramètres d'impression (dose UV et température de traitement) sous une fraction pondérale de Gelma fixe (5 % en poids) et des conditions d'impression (taille de la buse = 700 μm, vitesse de déplacement de la buse = 1 mm/s et pression pneumatique = 120 ± 10 kPa), un test à une seule ligne a été effectué.

Tout d'abord, nous avons mesuré les propriétés rhéologiques de la bioencre Gelma à 5 % en poids lors de balayages de température et de temps sous diverses doses d'UV (30, 90 et 150 mJ/cm2). Comme prévu, la bioencre Gelma pour le balayage de température présentait un comportement de transition sol-gel typique (Fig. 3a). De plus, l'augmentation de la dose d'UV à température constante (10 ° C) a amélioré le degré de réticulation de la bioencre Gelma (Fig. 3b).

Propriétés rhéologiques de 5% en poids de Gelma obtenues par (a) balayage de température et (b) balayage temporel à diverses doses d'UV. c Diagramme de processus illustrant l'effet de la température de traitement et de la dose d'UV sur le degré de réticulation des entretoises Gelma imprimées (pas de réticulation, réticulation insuffisante et réticulation stable). d Images optiques de la forme imprimée des entretoises Gelma traitées via OAB à diverses doses UV (0, 90 et 120 mJ/cm2) et images optiques des entretoises imprimées à 7 jours de culture. e Rapports de gonflement de matrice (diamètre de la tige imprimée/diamètre de la buse) pour différentes doses d'UV. f Dégradation des entretoises Gelma imprimées déterminée à l'aide de la différence de diamètre observée avant et après 7 jours de culture. Barre d'échelle, 1 mm (d—entretoise) ; 500 µm (d—cultivé).

Pour observer l'effet de la température de la bioencre Gelma sur le degré de photo-réticulation, nous avons sélectionné trois températures de traitement typiques : (1) région de gel : 10 °C, (2) région de transition gel-sol : 20 °C et (3) région de sol : 30 °C pour diverses doses d'UV (0 à 150 mJ/cm2). Pour la température de la région du sol (30 ° C), une photo-réticulation stable de l'entretoise Gelma imprimée n'a pas été obtenue quelle que soit la dose d'UV appliquée (0 à 150 mJ / cm2), alors que pour les entretoises Gelma imprimées aux températures de transition gel et gel-sol et avec plus de 60 mJ / cm2 de doses UV, des entretoises Gelma réticulées ont été formées de manière stable (Fig. 3c). Le degré de photoréticulation pour différentes températures sol-gel de Gelma bioink était cohérent avec celui rapporté dans l'étude menée par Chansoria et al.26. Selon leurs recherches, le module de compression de Gelma bioink dépendait fortement non seulement des conditions d'exposition aux UV, mais également de la température de photoréticulation ; le module a augmenté à des températures de réticulation plus basses (température de gel, 10 ° C) de Gelma. Ce résultat a été obtenu car la photo-réticulation de la solution de Gelma à basse température pouvait induire un effet synergique des réseaux polypeptidiques étroitement intriqués à basse température et leur photo-réticulation par liaison covalente26.

De plus, pour démontrer la stabilité structurelle après la photo-réticulation/impression, nous avons mesuré le rapport de gonflement de la matrice (D1/D0, où D0 et D1 indiquent le diamètre de la buse intérieure et le diamètre de l'entretoise à l'extrémité de la buse, respectivement) et le changement de la section transversale des entretoises Gelma après 7 jours dans la solution PBS. La figure 3d et la figure supplémentaire 2a représentent des images optiques de la jambe de force Gelma imprimée près de la buse d'impression à une température d'impression fixe (10 ° C) et à diverses doses UV (0 à 120 mJ / cm2). En raison du faible degré de réticulation de Gelma exposé à des doses UV de 0 et 30 mJ/cm2, le taux de gonflement était significativement plus élevé que celui du Gelma imprimé réticulé à des doses UV plus élevées (90 et 150 mJ/cm2) (Fig. 3e). De plus, la circularité de l'entretoise extrudée a augmenté de manière significative jusqu'à 120 mJ/cm2, cependant, l'augmentation supplémentaire de la dose d'UV n'a pas affecté la circularité (Fig. 2b supplémentaire). De plus, la vitesse d'écoulement (Fig. 2c, d supplémentaires) et la distance entre la fibre optique et la sortie de la buse (Fig. 2e, f supplémentaires) ont été étudiées à l'aide d'une dose UV fixe (120 mJ / cm2). En conséquence, la vitesse d'écoulement a eu des effets négligeables sur la circularité des entretoises extrudées, alors que la distance accrue entre la distance entre la fibre optique et la buse a amélioré la circularité. Un résultat similaire a été observé pour le comportement de dégradation (= [A0 - A1] / A0, où A0 et A1 désignent les aires de section transversale des entretoises imprimées in situ et la surface de l'entretoise à 7 jours, respectivement) des entretoises Gelma (Fig. 3f). Pour des doses d'UV inférieures à 90 mJ/cm2, la dégradation des entretoises était extrêmement rapide en raison de degrés de réticulation insuffisants. Sur la base des résultats obtenus à l'aide de la formation et des dimensions des entretoises, nous avons pu sélectionner les paramètres appropriés pour la dose d'UV (120 mJ/cm2).

Après avoir fixé la dose d'UV, nous avons étudié différentes températures de chemise d'eau (4, 10 et 20 ° C), comme indiqué dans les Fig. 3a, b supplémentaires. En conséquence, l'homogénéité de l'entretoise extrudée mesurée à l'aide de la circularité et du lissé de surface a montré que l'entretoise traitée avec la température relativement basse de la chemise d'eau (4 ° C) indiquait une circularité significativement plus élevée et une surface plus lisse par rapport à celles des autres températures. Cela peut être attribué au fait que la réticulation UV simultanée de Gelma à des températures plus basses peut induire une stabilité structurelle expressive27,28. De plus, lorsque la température de la chemise d'eau est fixée à 4 °C, la température d'impression mesurée est de 10 °C. Après avoir fixé la dose d'UV et la température d'impression, l'effet de la fraction pondérale de Gelma sur le degré de réticulation a été observé. La figure supplémentaire 4a, b illustre le module de stockage pour les trois fractions pondérales (3, 5 et 7 % en poids) de la bioencre Gelma. Comme prévu, les bio-encres Gelma ont démontré une transition sol-gel similaire pour le balayage de température, et une réticulation sous une dose UV fixe (120 mJ/cm2) et une température d'impression (10 °C) a été obtenue. Après avoir utilisé les conditions de traitement UV et fixes, nous avons enregistré les images optiques et mesuré le taux de gonflement de la matrice et la dégradation des entretoises Gelma imprimées à l'aide du processus OAB (Fig. 4c – e supplémentaire). Pour toutes les concentrations de Gelma bioink, un rapport de gonflement de filière d'environ 1 a été observé ; cependant, une réticulation insuffisante a été observée sur la bioencre Gelma à 3% en poids (Fig. 4e supplémentaire). Sur la base des résultats, nous avons utilisé une concentration de Gelma de 5 % en poids et les paramètres d'impression suivants : dose UV = 120 mJ/cm2 et température d'impression = 10 °C pour une évaluation plus approfondie. Comme le montre la Fig. 5 supplémentaire, la dispersion de la lumière UV à l'intérieur de la buse à l'aide des paramètres définis peut évoquer une réticulation dans la région centrale de l'entretoise extrudée, tandis que la région de la coque est relativement moins réticulée. Sur la base de ces données, nous prédisons soigneusement que les paramètres optimisés du système OAB peuvent permettre la fabrication de structures 3D multicouches.

Récemment, les hydrogels de forme-morphing ou les systèmes de biofabrication 4D ont attiré l'attention en raison de l'activation du biomimétisme et de la formation de microarchitecture complexe29,30,31. Pour étendre le processus OAB à la fabrication 4D de diverses architectures biologiques complexes, nous avons attaché deux fibres optiques (fibre optique-1 et fibre optique-2) dans une buse, illustrée dans l'image schématique de la figure 4a. Dans l'image, lorsque la fibre optique 1 a été allumée, la photo-réticulation asymétrique de la structure Gelma imprimée peut être atteinte. En général, une propriété élastique élevée (≈ degré de réticulation élevé) induite par un faible gonflement à l'eau32, de sorte que le degré de réticulation asymétrique de l'hydrogel semble déterminer la direction de la courbure de l'hydrogel. La figure 4b décrit le mécanisme de courbure en détail, et l'image optique de l'entretoise Gelma qui a été fabriquée à l'aide du processus de photo-réticulation asymétrique peut indiquer la réticulation asymétrique de l'entretoise. Les figures 4c, d montrent la capacité de courbure des entretoises Gelma en fonction de l'utilisation des fibres optiques. Lorsqu'elles sont exposées à l'eau, les entretoises Gelma photo-réticulées asymétriquement ont initié le taux de gonflement différent, et divers comportements de gonflement se sont produits dans la direction transversale de l'entretoise en raison du degré de réticulation différent, formant des structures en spirale et en forme de s. Sur la base de la preuve de concept démontrée de la fabrication 4D, nous prédisons soigneusement que le système OAB peut être appliqué dans diverses applications biologiques telles que la formation de vaisseaux sanguins ou les greffes nerveuses.

a Optique et schématique de la photo-réticulation asymétrique à l'aide de deux fibres optiques. b Mécanisme de morphing de forme de l'entretoise Gelma et image optique de l'entretoise Gelma fabriquée. Capacité de courbure (formation de spirale en c et de courbe en d) des entretoises Gelma en fonction de la réticulation asymétrique des entretoises Gelma. Barre d'échelle, 100 µm (b) ; 5 mm (c, d).

Comme indiqué dans la section précédente, l'un des avantages du procédé OAB est que les bio-encres photo-réticulables peuvent être réticulées dans la buse, quelle que soit la transparence du matériau de la buse et la complexité de la buse. Trois buses différentes (buse en verre, buse en plastique opaque et buse en acier pressé) ont été utilisées pour démontrer la faisabilité du procédé OAB, indépendamment de la conception spécifique de la buse. Comme illustré sur la Fig. 5a, une buse en verre a été utilisée pour extruder la bioencre Gelma, et les entretoises Gelma imprimées avec les procédés CB et OAB dans les conditions UV et d'impression précédemment définies ont démontré une forme cylindrique complètement similaire (Fig. 5b). Cependant, lorsque le processus OAB a été utilisé en utilisant la buse en acier ellipsoïdale illustrée à la Fig. 5c, une entretoise Gelma avec une forme plus similaire à la forme de la buse en coupe transversale en acier que la forme de la jambe imprimée avec le processus CB a été obtenue (Fig. 5c, d).

a Images optiques de surface et en coupe transversale des entretoises Gelma imprimées traitées via CB et OAB (dose UV = 120 mJ/cm2) et b circularité des images en coupe transversale. c, d Une buse en acier avec une forme en coupe ellipsoïdale, des entretoises Gelma imprimées traitées via CB et OAB, et le rapport d'aspect (longueur de l'axe long (L1)/longueur de l'axe court (L0) de l'entretoise imprimée) déterminé à l'aide des images optiques en coupe transversale des entretoises imprimées. e Images optiques de trois buses en plastique avec différentes formes de coupe transversale (N-1 : rond, N-2 : plus, N-3 : étoile) et formes imprimées de Gelma en coupe transversale fabriquées à l'aide de chaque buse en plastique et du procédé OAB. N-3-CB indique l'image optique en coupe transversale de Gelma traitée avec la forme de buse en plastique N-3 mais réticulée via le processus CB, pas le processus OAB. f Images optiques montrant diverses structures Gelma 3D utilisant la buse N-3 et le processus OAB et (g) images optiques et de fluorescence (collagène : rouge et fibronectine : vert) de la surface et des entretoises Colma et dECM-ma en coupe transversale fabriquées à l'aide de la buse en plastique N-3 et du processus OAB. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Les valeurs p ont été calculées par le test t de Student (n = 3/groupe ; *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001). Barre d'échelle, 1 mm (a, c-buse et strut,); 200 µm (a, c - coupe transversale de l'entretoise, e - SEM, g - fluorescence et coupe transversale) ; 500 µm (c, e - coupe transversale de la buse, f - coupe transversale, g - images optiques de la buse) ; 5 mm (f - vue de côté et vue de dessus).

De plus, trois buses en plastique opaques avec différentes formes de coupe [ronde (N-1), en forme de plus (N-2) et en forme d'étoile (N-3)] ont été utilisées pour imprimer la bioencre Gelma en utilisant le processus OAB, comme illustré à la Fig. 5e. Les images en coupe transversale des entretoises Gelma imprimées avec le procédé OAB présentent des formes similaires à celles des buses d'impression, tandis que l'entretoise Gelma (N-3-CB) imprimée avec la buse N-3 et le procédé CB ne présente pas une forme similaire à celle de la buse d'impression (en forme d'étoile en coupe). De plus, la Fig. 6 supplémentaire représente des images optiques d'une jambe de force Gelma imprimée avec des buses N-2 et N-3 à diverses doses UV (0–150 mJ/cm2). Pour montrer les formes Gelma 3D fabriquées à l'aide du processus OAB et de la buse N-3, nous avons fabriqué les formes avec trois structures différentes, illustrées à la Fig. 5f.

Pour étendre la faisabilité du procédé OAB à différents hydrogels méthacrylés, un collagène méthacrylé (Colma) (degré de méthacrylation : 79,3 ± 1,6 %) et du méthacrylate dECM (dECM-ma, degré de méthacrylation : 76,0 ± 2,4 %) dérivé du tissu musculaire squelettique ont été utilisés. Un schéma des processus de décellularisation / méthacrylation utilisant du tissu musculaire porcin a été décrit (Fig. 7a supplémentaire), et les contenus en ADN et en collagène, en élastine et en GAG pour le tissu musculaire, Colma et dECM-ma ont été présentés (Fig. 7b – e supplémentaire). La figure 5g montre les images optiques et de fluorescence de surface et en coupe transversale (collagène : rouge, fibronectine : vert) des entretoises imprimées en utilisant la buse N-3 et le processus OAB. Le motif de surface micro-rainuré a été clairement observé dans les entretoises Colma et dECM-ma.

En adoptant les paramètres d'impression suivants : dose UV = 120 mJ/cm2, température = 10 °C, pression d'impression = 120 ± 10 kPa, vitesse de déplacement de la buse = 1 mm/s, des filaments Gelma chargés de cellules (5 % en poids de Gelma, densité C2C12 de 1 × 107 cellules/mL) ont été fabriqués à l'aide des procédés CB et OAB-N-3 (forme de buse : N-3). Comme illustré sur la figure 6a, les images optiques de surface et en coupe transversale des entretoises Gelma chargées de cellules présentent des formes rondes et en étoile pour les entretoises traitées avec CB et OAB-N-3, respectivement. Les images vivantes (vertes) / mortes (rouges) et la viabilité cellulaire (CB = 92, 5 ± 2, 2% et OAB-N-3 = 91, 9 ± 1, 8%) des entretoises à 1 et 3 jours de culture cellulaire ont révélé que les processus, y compris chaque procédure de photo-réticulation, étaient sans danger pour les cellules chargées (Fig. 6b, c).

a Images de surface optique et en coupe transversale des entretoises Gelma traitées à l'aide des procédés CB et OAB avec la buse N-3. b Vivant (vert)/mort (rouge) à 1 et 3 jours de culture et (c) viabilité cellulaire pour chaque entretoise Gelma. d Prolifération cellulaire déterminée à l'aide du test MTT pour les entretoises Gelma. e DAPI (bleu)/phalloïdine (rouge) à 14 jours de culture et (f) DAPI/MHC (vert) à 21 jours de culture (la boîte blanche indique la région agrandie). g Facteur d'orientation du CMH, indice positif et indice de fusion pour les entretoises Gelma chargées de C2C12 à 21 jours de culture cellulaire. h Expression génique relative du CMH et de la troponine T dans les structures CB et OAB-N-3 à 14 et 21 jours de culture cellulaire. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Les valeurs p ont été calculées par le test t de Student (n = 5/groupe ; *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001). Barre d'échelle, 500 µm (a—surface, e, f—panneau supérieur) ; 200 µm (a - coupe transversale, b) ; 100 µm (e, f—panneau inférieur).

De plus, nous avons mesuré la prolifération cellulaire à l'aide du test MTT pour les entretoises et avons découvert que le taux de prolifération n'était pas significativement différent entre les entretoises. Pour observer la morphologie cellulaire des entretoises de Gelma, des images DAPI (bleu)/phalloïdine (rouge) ont été capturées après 14 jours de culture cellulaire. Dans les images enregistrées, une F-actine alignée uniaxialement a été observée dans la jambe de force Gelma avec un motif de surface rainuré fabriqué à l'aide du procédé OAB-N-3, alors que dans la jambe imprimée avec le procédé CB, un alignement uniaxial similaire de la F-actine n'a pas été atteint (Fig. 6e). De plus, les images DAPI / MHC (vertes) à 21 jours de culture cellulaire présentaient des CMH bien alignés et accélérés, déterminés par le facteur d'orientation (= [90 - φ] / 90, où φ = pleine largeur à mi-hauteur dans une distribution d'alignement), et des valeurs d'indice / indice de fusion plus positives ont été observées dans les entretoises Gelma traitées avec OAB-N-3 que dans les entretoises traitées avec CB (Fig. 6f, g).

Pour observer la différenciation myogénique des entretoises de Gelma imprimées, l'expression du gène myogénique (CMH et troponine T) a été observée à 14 et 21 jours de culture cellulaire (Fig. 6h). Les gènes myogéniques ont été régulés positivement dans le groupe Gelma traité avec OAB-N-3 ; cela était dû au repère topographique (forme de rainure) à l'intérieur de la buse, qui a été spécialement conçu pour induire l'alignement des cellules. Ces résultats sont en bon accord avec les résultats de plusieurs études qui ont démontré que divers échafaudages avec des motifs topographiques uniaxiaux peuvent ajuster l'alignement des myoblastes et même la formation de myotubes33,34,35. Ici, des cellules C2C12 immortalisées ont été utilisées pour évaluer les activités cellulaires in vitro. Cependant, les résultats in vitro peuvent différer lors de l'utilisation de cellules primaires autologues ou allogéniques.

Les entretoises Gelma chargées de hASC fabriquées à l'aide des processus CB, OAB-N-1 (forme de buse : N-1) et OAB-N-3 (forme de buse : N-3) ont été appliquées à la régénération tissulaire VML, qui a été obtenue en excisant 40 % d'un muscle TA original dans un modèle murin36. Dans cette analyse, nous avons utilisé des hASC pour soutenir la régénération de VML défectueux37,38 car la différenciation des hASC en plusieurs lignées cellulaires, y compris une lignée myogénique, peut être induite par divers stimuli chimiques et physiques39. Comme illustré à la Fig. 7a, les constructions fabriquées de Gelma chargées de hASC (densité cellulaire = 1 × 107 cellules / ml, taille = 2 × 4 × 1, 6 mm3) (CB, OAB-N-1 et OAB-N-3) ont été appliqués dans la région musculaire défaillante. Comme prévu, les hASC étaient vivants dans les trois structures et les cellules chargées dans le groupe OAB-N-3 étaient bien alignées dans le sens de l'impression par rapport à celles de CB et OAB-N-1 (Fig. 7a – c).

a Images optiques, vivantes/mortes aux jours 1 et 3, et images DAPI/phalloïdine aux jours 7 et 14 des constructions musculaires CB et OAB (OAB-N-1 et OAB-N-3) chargées de cellules souches adipeuses humaines traitées avec les buses N-1 et N-3, respectivement. b Viabilité cellulaire des constructions musculaires à 1 et 3 jours de culture cellulaire (n = 5 par groupe, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon) et (c) facteur d'orientation utilisant la F-actine à 14 jours de culture cellulaire (n = 5 par groupe, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon). d Aspect brut des constructions implantées dans le défaut du muscle TA. Quantifié (e) force de préhension, (f) test de latence à la chute et (g) poids musculaire après 4 semaines d'implantation (n = 5 par animal, trois mesures répétées par échantillon). h H&E (violet : noyaux, rose : cytoplasme), MT (rouge : fibre musculaire, bleu : collagène) et DAPI/MHC (vert) des sites transplantés, (i) zone fibreuse (%) (n = 5 par groupe, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon), (j) myofibres à nucléation centrale (%) (n = 5 par groupe, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon), (k) zone de myofibres à nucléation périphérique (%) (n = 5 par groupe, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon), (l) diamètre des myofibres (μm) (n = 25 par groupe, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon) et (m) zone MHC-positive (%) (n = 5 par groupe, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon) pour les échantillons factices, défauts uniquement, CB, OAB-N-1 et OAB-N-3. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Les valeurs de p ont été calculées par le test t de Student (b, c) et une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey (e–m) (non-signification statistique NS, *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001). Barre d'échelle, 2 mm (a—optique, d) ; 500 µm (a—vivant/mort, h–H&E) ; 100 µm (a-DAPI/phalloïdine) ; 50 µm (h—H&E grossie, MT, DAPI/MHC).

Pour évaluer l'efficacité de la régénération musculaire VML, cinq groupes : (1) simulacre (pas de défaut), (2) seul défaut, (3) CB, (4) OAB-N-1 et (5) groupe OAB-N-3 ont été implantés dans le modèle de souris (Fig. 7d). L'évaluation de la force de préhension et de la latence à la chute est une évaluation fiable de l'efficacité de la régénération musculaire14,40,41,42. En tant que tels, les résultats du test de force de préhension et du test de latence de chute chez la souris 4 semaines après l'implantation des constructions sont présentés sur la Fig. 7e – g. Le groupe OAB-N-3 a montré une force de préhension significativement plus élevée que les autres groupes et une force de préhension similaire à celle du faux (Fig. 7e). Cependant, le temps de latence à la chute a montré une latence relativement plus longue à la chute par rapport aux autres groupes, mais était significativement inférieur à celui du groupe fictif (Fig. 7f). Nous attribuons ces résultats à la dénervation des fibres musculaires après le défaut VML, entraînant une altération fonctionnelle42,43,44. Pour évaluer cet effet, les sections musculaires récoltées ont été colorées avec des récepteurs de l'acétylcholine (AchR) (Fig. 8a supplémentaire). Des expressions significativement plus élevées d'AchR ont été observées chez les souris ayant reçu OAB-N-3 par rapport aux autres groupes (Fig. 8b supplémentaire). De plus, le poids musculaire du groupe OAB-N-3 était très similaire à celui du groupe fictif (Fig. 7g). La figure 7h illustre les résultats histologiques longitudinaux de la coloration H&E, MT et DAPI/MHC, et la Fig. 9 supplémentaire montre la coloration transversale H&E. Les zones fibrotiques, les myofibres à nucléation centrale, les zones de myofibres à nucléation périphérique, le diamètre des myofibres et la zone positive au CMH ont été mesurées et les résultats sont présentés sur la Fig. 7i – m. Comme illustré dans les résultats, une régénération musculaire plus efficace et un faible degré de fibrose (zone bleue dans la coloration MT) ont été détectés dans le groupe OAB-N-3 par rapport aux valeurs correspondantes dans les groupes CB et OAB-N-1, démontrant que les indices topographiques, causés par la rainure de la buse utilisée dans le processus OAB-N-3. En outre, les fibres musculaires à nucléation centrale sur les sections musculaires prélevées sur les souris traitées avec OAB-N-3 étaient considérablement inférieures à celles du défaut, CB et OAB-N-142,45,46. Sur la base de ces résultats, nous prédisons soigneusement que la bioconstruction OAB-N-3 peut induire une régénération musculaire plus efficace que celle des groupes CB et OAB-N-1 sans aucun indice topographique.

Plus intéressant encore, les myofibres formées dans les constructions implantées provenaient des hASC imprimées dans le CB, OAB-N-1 et OAB-N-3, respectivement, comme confirmé par double immunofluorescence pour MHC/MRPL11 et MHC/HLA-A à 4 semaines après l'implantation (Fig. 8a). En particulier, on peut observer que le groupe OAB-N-3 a des fibres musculaires positives MRPL11 et HLA-A significativement plus élevées que les autres groupes (CB et OAB-N-1) (Fig. 8b, c). Sur la base des résultats histologiques, nous pouvons conclure que la régénération musculaire à l'aide de la construction Gelma chargée de cellules traitée à l'aide du processus OAB-N-3 peut être accélérée par rapport à celle utilisant la construction Gelma traitée à l'aide du processus CB et OAB-N-1. Cependant, malgré ces résultats de régénération musculaire favorables concernant la construction proposée (OAB-N-3), il convient de souligner qu'en raison de la petite taille des défauts du modèle de souris VML, la pertinence clinique fait défaut.

a Images en double immunofluorescence de DAPI (bleu)/MHC (rouge)/MRPL 11 (vert) et DAPI (bleu)/MHC (rouge)/HLA-A (vert). Quantifié (b) MRPL11 et (c) HLA-A positif myofiber (%) (n = 5 par groupe, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon). Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. Les valeurs p ont été calculées par ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey (NS = non-significativité statistique, *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001). Barre d'échelle, 200 µm (a—DAPI/MHC/MRPL11) ; 50 µm (a—DAPI/MRPL11, DAPI/HLA-A); 100 µm (a—DAPI/MHC/HLA-A).

Dans cette étude, nous avons développé un nouveau procédé de bioimpression complété par une méthode de photo-réticulation assistée par fibre optique pour fabriquer des filaments chargés de cellules avec des surfaces à micromotifs pour des applications d'ingénierie tissulaire. Pour obtenir des entretoises chargées de cellules biofonctionnelles avec un repère topographique, des paramètres d'impression appropriés, tels que la dose UV et la température d'impression, ont été soigneusement sélectionnés. Pour démontrer la faisabilité du processus de bio-impression, des myoblastes C2C12 et des hASC ont été utilisés pour observer les activités myogéniques in vitro et les défauts musculaires volumétriques in vivo, respectivement, dans un modèle de souris. En raison du phénotype biomimétique sur les constructions Gelma chargées de cellules traitées avec OAB-N-3, une réparation VML in vivo améliorée a été observée par rapport aux bioconstructions imprimées via les procédés d'impression conventionnels. Sur la base de ces résultats, nous pensons que le processus de bioimpression nouvellement conçu combiné à la réticulation assistée par fibre optique peut constituer une approche prometteuse pour la fabrication de constructions chargées de cellules biofonctionnelles pour une application dans diverses régénérations tissulaires.

Le système de bioimpression assistée par fibre optique était composé de trois parties principales : une imprimante 3D (DTR3-2210 T-SG ; DASA Robot, Corée), un générateur d'ultraviolets (UV) avec une tête de point UV (LGA-20562 ; Liim Tech, Corée), et une buse combinée à une fibre optique, comme présenté sur la Fig. 1a à c. Des fibres optiques en silice (diamètre = 200 μm, longueur = 5,5 cm, ouverture numérique = 0,22, Edmund Optics, NJ, USA) à faible atténuation du rayonnement UV (40 db/km) ont été achetées chez Edmund Optics (Barrington, NJ, USA). Des buses en plastique ont été fabriquées à l'aide d'une imprimante 3D numérique à traitement de la lumière (X-CUBE3, Foshan Stek Technology, Chine) avec une résine d'acrylate photodurcissable (3DV-301 ; WOW 3D, Corée du Sud). Après impression, les buses ont été lavées à l'éthanol et séchées à température ambiante. Par la suite, la fibre optique a été insérée dans les buses en plastique.

La méthacrylation de la gélatine a été effectuée comme indiqué précédemment47. En bref, de la gélatine (10 % en poids ; 300 g de Bloom ; Sigma-Aldrich) obtenue à partir de peau de porc a été dissoute dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). De l'anhydride méthacrylique (Sigma-Aldrich, USA) a été ajouté goutte à goutte à 50 °C et la solution a été agitée à 500 tr/min pendant 3 h. Gelma a été dialysé dans de l'eau distillée à l'aide d'une membrane de dialyse de poids moléculaire de 12 kDa (Thermo-Fisher Scientific, USA) à 40 ° C pendant 7 jours pour éliminer l'anhydride méthacrylique restant. Enfin, Gelma a été lyophilisé et stocké dans un congélateur.

La solution de Gelma (5% en poids) a été dissoute dans du PBS contenant du phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (0,05% en poids; Sigma-Aldrich, USA) à 37 ° C. Pour stériliser les hydrogels Gelma, des filtres à seringue de 0,22 μm (Thermo-Fisher Scientific, USA) ont été utilisés. Deux bioinks Gelma différents ont été obtenus en les mélangeant avec des myoblastes de souris C2C12 (CRL-1772 ; ATCC, Manassas, VA, USA) et des hASC (PT-5006 ; Lonza, Bâle, Suisse) à une densité de 1 × 107 cellules/mL.

Un rhéomètre rotatif Bohlin Gemini HR Nano (Malvern Instruments, Royaume-Uni) équipé d'une géométrie acrylique à plaques parallèles (diamètre = 40 mm et espace = 200 μm) a été utilisé pour évaluer les propriétés rhéologiques des bio-encres Gelma. Un test de balayage temporel (contrainte = 1 % ; température = 10 °C ; et fréquence = 1 Hz) de la Gelma bioink a été réalisé dans diverses conditions UV. Un test de balayage de température (4–45 °C) de la solution de Gelma a été effectué à une vitesse de rampe (5 °C/min) sous une fréquence fixe de 1 Hz et une contrainte de 1 %.

Une buse à fibre optique, couplée à un système d'impression à trois axes (DTR3-2210 T-SG ; DASA Robot, Corée) et un système de distribution (AD-3000C ; Ugin-tech, Corée), a été utilisée pour fabriquer les constructions chargées de cellules. Les paramètres du processus étaient les suivants : vitesse de déplacement de la buse = 2 mm/s, débit bioink = 0,045 ml/min, température du baril = 10 °C et température de la chemise d'eau = 4 °C. Au cours du processus d'extrusion, la bioencre a été simultanément exposée à une dose UV [(dose = Iv × t ; Iv = intensité UV (20 mW/cm2), t = temps d'exposition UV (6 s)] de 120 mJ/cm2 pour la réticulation. L'intensité UV a été mesurée à l'aide d'un photomètre UV (LS125 ; Linshang, Chine).

La caractérisation morphologique a été réalisée à l'aide d'un microscope optique (BX FM-32 ; Olympus, Tokyo, Japon) équipé d'un appareil photo numérique et d'un microscope électronique à balayage (SNE-3000M ; SEC, Inc., Corée du Sud). Le logiciel ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis) a été utilisé pour détecter les différences entre les valeurs de gris transversales, la circularité (= 4π × A/P2, où A = aire et P = périmètre) et le rapport d'aspect déterminé par la longueur la plus longue/longueur la plus courte. Le taux de biodégradabilité a été évalué en immergeant les échantillons dans du PBS à 37 °C pendant 7 jours. Les différences dans les changements de diamètre des entretoises ont été prises en compte pour mesurer le taux de dégradation.

Des analyses mécaniques, y compris des essais de traction et de cisaillement des structures, ont été effectuées à l'aide d'une machine de traction universelle (Toptech 2000 ; Chemilab, Corée). Pour mesurer les propriétés de traction, les échantillons (10 × 3 × 1,6 mm3) ont été testés à une vitesse de 0,5 mm/s à l'aide d'une cellule de charge de 30 kgf. Pour calculer les propriétés d'adhérence entre les constructions imprimées (10 mm × 25 × 1,6 mm3), le test de cisaillement était basé sur la norme ASTM F2255-0548 avec une vitesse d'étirement de 0,5 mm/s.

Pour l'évaluation in vitro, des constructions chargées de cellules (myoblastes C2C12 ou hASC) avec des densités cellulaires de 1 × 107 cellules/mL et des dimensions de 6 × 30 × 1,6 mm3 ont été bioimprimées. Les constructions chargées de C2C12 ont été cultivées dans des plaques de culture tissulaire à six puits avec du milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) à haute teneur en glucose contenant 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen-Strep, Thermo-Fisher Scientific, États-Unis) et 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Gemini Bio-Products, États-Unis). De plus, nous avons utilisé du DMEM riche en glucose additionné de 2 % de sérum de cheval (Sigma-Aldrich St Louis, États-Unis) pour induire la myogenèse. Les constructions chargées de hASC ont été cultivées dans des plaques de culture tissulaire à six puits avec du DMEM à faible teneur en glucose contenant 1 % de Pen-Strep et 10 % de FBS. De plus, nous avons utilisé un supplément DMEM à faible teneur en glucose contenant 5 % de sérum de cheval, 0,1 μM de dexaméthasone et 50 μM d'hydrocortisone. Le milieu de tous les échantillons a été changé tous les 3 jours.

La viabilité cellulaire dans les constructions chargées de cellules a été étudiée à l'aide d'un kit de test vivant/mort (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) conformément aux instructions du fabricant. Les constructions chargées de cellules ont été collectées après 1 jour de culture, lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) et incubées dans une solution de réactif (0, 15 mM / ml de calcéine AM et 2 mM d'éthidium homodimère-1 dans du DPBS) à température ambiante pendant 40 min pour le test vivant / mort. Trois images des échantillons colorés ont été capturées à l'aide d'un microscope confocal (LSM 700; Carl Zeiss, Allemagne) après un lavage doux avec du DPBS. À l'aide de ces images, nous avons quantifié la valeur moyenne de la viabilité cellulaire (%) comme le rapport des cellules vivantes aux cellules totales en comptant le nombre de cellules vivantes (vert) et de cellules mortes (rouge) à l'aide du logiciel ImageJ.

L'activité métabolique cellulaire au sein de la construction a été mesurée à l'aide d'un kit de dosage du bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5 diphényltétrazolium (MTT) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne). Après 1, 3 et 7 jours de culture, l'activité de la déshydrogénase mitochondriale dans les cellules vivantes a été mesurée à une absorbance de 570 nm après exposition à 0,5 mg/mL de la solution MTT à 37 °C pendant 4 h. Les valeurs d'absorbance obtenues à partir de constructions acellulaires ont été soustraites de celles obtenues à partir des constructions chargées de cellules.

Les constructions bioimprimées contenant des myoblastes C2C12 et des hASC ont été fixées dans 3, 7% de paraformaldéhyde (Sigma-Aldrich) pendant 30 min, bloquées à l'aide d'un agent bloquant les protéines sans sérum (Agilent) pendant 1 h et perméabilisées avec 0, 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) pendant 3 min. Le cytosquelette des cellules dans les constructions bio-imprimées a été visualisé par immunofluorescence à l'aide de phalloïdine conjuguée à Alexa Fluor 594 (rouge; 1: 100 dans DPBS; Invitrogen), et les noyaux ont été colorés avec du diamidino-2-phénylinodole (DAPI) (bleu; 1: 100 dans DPBS; Invitrogen). Le facteur d'orientation [=(90° − φ)/90°, φ = pleine largeur à mi-hauteur (FWHM)] a été analysé à l'aide du logiciel ImageJ.

Pour l'immunofluorescence de la chaîne lourde de la myosine (MHC), les constructions bio-imprimées ont été traitées avec un anticorps primaire anti-MF20 (5 μg/ml; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA, USA) et incubées pendant une nuit à 4 ° C. Les échantillons ont ensuite été lavés avec du DPBS et incubés avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor 488 (vert; 1:50 dans du DPBS; Invitrogen) pendant 1 h. Enfin, les noyaux ont été colorés au DAPI. Les images immunofluorescentes MHC/DAPI ont été visualisées et capturées à l'aide d'un microscope confocal, et la maturité des myofibres (indice MHC-positif et indice de fusion) a été quantifiée à l'aide du logiciel ImageJ.

Pour l'analyse quantitative en temps réel de la transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase (qRT-PCR), les constructions bio-imprimées ont été collectées après 14 et 21 jours de culture, et des marqueurs de gène myogénique du CMH et de la troponine T ont été utilisés. En bref, les constructions chargées de cellules ont été traitées avec un réactif TRIzol (Sigma-Aldrich) pour isoler l'ARN. La concentration et la pureté de l'ARN ont été mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre (FLX800T ; BioTeK, USA). Les échantillons d'ARN ont été traités avec de la DNase sans RNase avant la synthèse d'ADNc. Les échantillons d'ADNc ont été synthétisés à l'aide du Power SYBRVR Green qPCR Master Mix (Qiagen). Un système de PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems, USA) a été utilisé pour effectuer une analyse RT-PCR, selon le protocole du fabricant. Le gène domestique glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) a été utilisé pour la normalisation. Les séquences d'amorces spécifiques pour les gènes cibles sont répertoriées dans le tableau 1.

Des défauts musculaires TA ont été créés chez des souris C57BL / 6 (mâles, 10 semaines, DooYeol Biotech, Inc., Séoul, Corée), et toutes les procédures animales ont été effectuées conformément au protocole approuvé par le comité consultatif de recherche et de protection des animaux institutionnels au centre de recherche sur les animaux de laboratoire de la Sungkyunkwan University School of Medicine et respectées les règlements du comité d'éthique institutionnel (SKKUIACUC2021-08-11-2). En bref, les souris ont été réparties au hasard en cinq groupes (total de 25 souris, n = 5 par groupe). Avant l'implantation, les souris ont d'abord été anesthésiées à l'aide d'isoflurane à 3 % v/v, et leurs muscles ont été isolés du fascia par incision de la peau sous les pattes gauche et droite. Suite à cela, l'extensor digitorum longus et l'extensor hallucis longus ont été retirés pour induire une perte musculaire volumétrique (VML), et environ 40% des muscles TA ont été excisés et pesés (tableau supplémentaire 1). Pour la restauration de VML, des constructions bio-imprimées chargées de hASC (2 × 4 × 1, 6 mm3) ont été transplantées dans les régions de défaut musculaire TA et recouvertes de fascia et de peau suturés. Après l'implantation, les souris ont reçu une injection sous-cutanée de 0,5 mg/kg de buprénorphine pour contrôler la douleur et ont reçu de la nourriture et de l'eau normalement après l'opération. Après 4 semaines d'implantation, les souris ont été euthanasiées par inhalation de CO2 et dislocation cervicale secondaire. Avant la transplantation, les constructions chargées de hASC ont été cultivées dans un milieu de croissance pendant 1 jour pour stabiliser les cellules31,49.

La fonctionnalité des muscles squelettiques des souris ayant reçu divers traitements a été évaluée en mesurant la force de préhension et la latence à la chute. La force de préhension maximale des souris à 4 semaines après la transplantation a été mesurée en tirant la souris parallèlement à la ligne de grille et en mesurant la force de préhension (compteur de force de préhension, BIO-G53, BIOSEB, FL, USA)) selon la procédure décrite50. De plus, la latence à la chute a été évaluée en mesurant le temps écoulé après que la souris a été placée sur une tige. La période de latence maximale a été fixée à 300 s. Chaque expérience a été répétée trois fois par souris. Une durée d'intervalle de 5 min a été prévue entre les répétitions (n = 5 par animaux, trois mesures répétées par échantillon).

Pour la coloration histologique, les échantillons de muscle TA récoltés ont été fixés avec du formol tamponné neutre à 10 % pendant 24 h. Ensuite, les échantillons ont été déshydratés, inclus en paraffine et coupés en tranches de cinq microns d'épaisseur. Les coupes musculaires ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E) et du trichrome de Masson (MT). Les images colorées par H&E et les images colorées par MT ont été analysées par le logiciel ImageJ pour quantifier respectivement les myofibres à nucléation centrale, la zone de myofibres à nucléation périphérique et la zone fibrotique (n = 5 par échantillon, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon). Les myofibres à nucléation centrale et les fibres musculaires à nucléation périphérique sont comptées manuellement à l'aide de l'outil multipoint dans imageJ. La myofibre à nucléation centrale a été obtenue en divisant le nombre de myofibres à nucléation centrale par celui du nombre total de fibres musculaires. De plus, la surface des myofibres nucléées périphériquement a été calculée en divisant la surface des myofibres nucléées périphériquement par celle de la surface totale des fibres musculaires.

Pour la coloration par immunofluorescence, les échantillons sectionnés ont été traités avec un anticorps primaire anti-MF20 (5 μg/ml ; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA), anti-MRPL11 (protéine ribosomique antimitochondriale polyclonale de lapin L11, réactivité d'espèce : humain, dilution 1 : 100 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-HLA-A (réactivité d'espèce : humain, dilution 1 : 100 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni ), anti-CHRNB2 (sous-unité bêta-2 du récepteur neuronal de l'acétylcholine, dilution 1:100, Thermo-Fisher Scientific, États-Unis) et incubés pendant une nuit à 4 °C. Les échantillons ont ensuite été lavés avec du DPBS et incubés avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor 488 (vert; 1:50 dans DPBS; Invitrogen) ou des anticorps secondaires conjugués à Alexa 594 (rouge; 1:50 dans DPBS; Invitrogen) et des IgG anti-lapin conjugués à Alexa 488 (dilution 1:200, Invitrogen) pendant 1 h. Enfin, les noyaux ont été colorés au DAPI. Les images d'immunofluorescence MHC/DAPI ont été capturées à l'aide d'un microscope confocal. La surface de la fibre musculaire par champ (%) (n = 5 par échantillon, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon), le diamètre des myofibres (n = 25 par échantillon, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon) et la zone MHC-positive (%) (n = 5 par échantillon, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon) ont été mesurés avec des images immunofluorescentes pour MHC/DAPI (grossissement × 400) en aveugle. La surface des myofibres positives pour MRPL11 et HLA-A (%) a été mesurée avec des images à double immunofluorescence pour MHC/MRPL11 et MHC/HLA-A (grossissement × 400) en aveugle (n = 5 par échantillon, quatre champs aléatoires dans chaque échantillon). Toutes les images d'échantillon ont été quantifiées à l'aide du logiciel ImageJ. Toutes les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± écart type.

Le logiciel SPSS (SPSS, Inc., USA) a été utilisé pour effectuer les analyses statistiques. Les comparaisons de deux groupes ont été évaluées par test t, et trois groupes ou plus ont été comparés en évaluant une analyse de variance unidirectionnelle ou bidirectionnelle (ANOVA) avec le test post hoc HSD de Tukey. Les valeurs de *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 ont été considérées comme statistiquement significatives.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Cette étude a été soutenue par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le ministère des Sciences et des TIC pour le projet de développement de technologies d'innovation bioinspirée (NRF-2018M3C1B7021997 et NRF-2021R1A5A8029876 à DR) et le programme de recherche scientifique fondamentale (NRF-2021R1I1A1A01061021). Cette étude a également été soutenue par une subvention du ministère du Commerce, de l'Industrie et de l'Énergie (MOTIE, Corée) dans le cadre du programme d'innovation technologique industrielle (20009652 : Technologie de commercialisation et matériaux d'hydroxyapatite bioabsorbable de taille inférieure au micromètre).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : JaeYoon Lee, Hyeongjin Lee.

Département de médecine de précision, École de médecine de l'Université Sungkyunkwan, Suwon, République de Corée

JaeYoon Lee, Hyeongjin Lee et Geun Hyung Kim

Département de biotechnologie et de bioinformatique, Université de Corée, Sejong, République de Corée

Hyeongjin Lee

Département de biologie cellulaire moléculaire, École de médecine de l'Université Sungkyunkwan, Suwon, République de Corée

Eun-Ju Jin & Dongrieol Ryu

Département des sciences et de l'ingénierie biomédicales, Institut des sciences et technologies de Gwangju, Gwangju, République de Corée

Dongryeol Ryu

Département de biophysique, Institut de biophysique quantique, Université Sungkyunkwan, Suwon, République de Corée

Geun Hyung Kim

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Correspondance à Dongryeol Ryu ou Geun Hyung Kim.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Lee, J., Lee, H., Jin, EJ. et coll. Bioimpression 3D utilisant une nouvelle méthode de photo-réticulation pour la restauration des tissus musculaires. npj Regen Med 8, 18 (2023). https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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Reçu : 02 juillet 2022

Accepté : 17 mars 2023

Publié: 31 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41536-023-00292-5

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