Les protéines de queue du phage SU10 se réorganisent dans la buse pour la livraison du génome

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5622 (2022) Citer cet article

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Escherichia coli phage SU10 appartient au genre Kuravirus de la classe Caudoviricetes des phages à queues courtes non contractiles. Contrairement à d'autres phages à queue courte, les queues des Kuravirus s'allongent lors de la fixation cellulaire. Ici, nous montrons que le virion de SU10 a une tête allongée, contenant des protéines de génome et d'éjection, et une queue, qui est formée de protéines de porte, d'adaptateur, de buse et d'aiguille de queue et décorée de fibres longues et courtes. La liaison des fibres de la longue queue aux récepteurs de la membrane bactérienne externe induit le redressement des protéines de la buse et la rotation des fibres de la queue courte. Après le réarrangement, les protéines de la buse et les fibres de la queue courte alternent pour former une buse qui étend la queue de 28 nm. Par la suite, l'aiguille de la queue se détache des protéines de la buse et cinq types de protéines d'éjection sont libérées de la tête SU10. La buse avec l'extension putative formée par les protéines d'éjection permet la délivrance du génome SU10 dans le cytoplasme bactérien. Il est probable que ce mécanisme de délivrance du génome, impliquant la formation de la buse de queue, soit employé par tous les Kuravirus.

Les phages du genre Kuravirus appartiennent à la classe des Caudoviricetes des phages à queues courtes non contractiles1. Les kuravirus, y compris le phage SU10 d'Escherichia coli, se distinguent des phages à queue courte par de grands génomes avec 75 à 80 000 paires de bases codant pour plus de 50 protéines 2,3,4. Les kuravirus sont lytiques, et certains d'entre eux ont des cycles de réplication courts et produisent une progéniture abondante, ce qui en fait des candidats pour une utilisation en phagothérapie contre des souches pathogènes d'E. coli5,6,7. Un cocktail de phages contenant le phage ES17, du genre Kuravirus, a été utilisé dans une étude de cas pour traiter une infection à E. coli de la prostate et des voies urinaires8.

Les génomes des kuravirus sont logés dans des têtes allongées, caractérisées par une symétrie quintuple et un allongement dans la direction de l'axe de la queue2,3. Les génomes des phages à queue sont emballés dans des pro-têtes préformées par des moteurs moléculaires à travers un canal formé par le dodécamère des protéines portailes, qui remplace un pentamère des protéines de capside à l'un des cinq sommets de la capside. Les queues de phage sont attachées aux complexes porte9. Les composants communs de la queue des phages à queue courte infectant les bactéries Gram-négatives sont les protéines adaptatrices, les principales protéines de la queue, les protéines de l'aiguille de la queue et les fibres de la queue10. Les fibres de la queue permettent la liaison initiale des phages aux bactéries11,12,13, tandis que les aiguilles de la queue sont responsables de la pénétration de la membrane externe de la cellule hôte14,15. Les têtes de la plupart des phages à queue courte contiennent des protéines d'éjection, qui permettent la livraison des génomes de phage dans les cellules hôtes. Les protéines d'éjection forment un complexe de translocation qui allonge la queue pour couvrir la paroi cellulaire bactérienne 16,17,18,19. La pression à l'intérieur de la tête du phage permet l'éjection de 30 à 50 % du génome dans une cellule bactérienne20,21,22. Cependant, après égalisation des pressions à l'intérieur de la tête du phage et du cytoplasme bactérien, le reste de l'ADN doit être délivré dans la bactérie par un autre mécanisme21,23,24. Il a été montré, en utilisant la microscopie électronique à coloration négative, que le phage SU10 a une queue plus longue que la plupart des phages anciennement classés dans la famille des Podoviridae, et que la queue subit un changement conformationnel lors de la liaison aux bactéries2.

Nous présentons ici les structures de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) de l'intermédiaire de libération du virion et du génome du bactériophage SU10 et la caractérisation de la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) de son attachement aux cellules d'E. coli. Après la liaison à l'hôte, la queue SU10, les protéines de la buse et les fibres courtes se réarrangent pour former une buse qui prolonge la queue. Les kuravirus partagent plus de 70 % de similarité de séquence dans leurs protéines de queue. Par conséquent, il est probable que ce mécanisme de délivrance du génome, impliquant la formation de la buse de queue, soit utilisé par la plupart, sinon tous les Kuravirus.

Le virion du bactériophage SU10 a une tête allongée d'une longueur de 1430 Å et d'un diamètre de 460 Å, qui est formée par la principale protéine de capside (gp9) (Fig. 1a, Tableau supplémentaire 1, 2)2. La queue mesure 220 Å de long et est décorée de six fibres longues et de six fibres courtes (Fig. 1a – c, 2a, c, tableau supplémentaire 1, 2). La queue est attachée à l'un des sommets de la capside allongée, où le dodécamère des protéines portales (gp6) remplace un pentamère des protéines de la capside (Figs. 1a à c). La partie du complexe porte dépassant de la capside permet la liaison du dodécamère des protéines adaptatrices (gp11). Le complexe adaptateur fournit six sites de fixation pour les fibres à longue queue, chacun étant formé par un trimère de protéines proximales des fibres à longue queue (gp12) et un trimère de protéines distales des fibres à longue queue (gp13) (Figs. 1c, 2a, c) . Un hexamère de protéines de buse (gp17) est attaché au complexe adaptateur et permet la liaison de six fibres à queue courte, trimères de la protéine de fibre à queue courte (gp16) (Fig. 2a, c). L'aiguille de la queue, formée de trois chaînes polypeptidiques (gp18), dépasse du canal central formé par les protéines de la buse (Figs. 1a – c et 2a, c).

a Représentation en surface de la carte composite cryo-EM du virion du phage SU10 colorée selon le type de protéine. La principale protéine de capside (gp9) est représentée en turquoise, la protéine portale (gp6) en magenta, la protéine adaptatrice (gp11) en jaune, les fibres à longue queue (gp12) en violet, la protéine de la buse (gp17) en rouge, les fibres à queue courte (gp16 ) en vert et l'aiguille de la queue (gp18) en bleu clair. La longueur du virion est de 1590 Å. Pour plus de détails sur la construction de la carte composite, veuillez consulter la section Matériels et méthodes. b Identique à A, mais la moitié avant de la carte composite de la tête SU10 a été supprimée pour montrer la structure du génome en gris. L'encart montre une moyenne de classe 2D du virion SU10. La barre d'échelle indique 45 nm. c Carte cryo-EM composite des complexes porte et queue du virion SU10. La longueur du complexe est de 540 Å. D Reconstruction Cryo-EM des complexes porte et queue à partir d'un intermédiaire de libération du génome SU10. e Carte composite cryo-EM de l'intermédiaire de libération du génome de SU10. La moitié avant de la tête a été enlevée pour montrer la structure du génome restant dans la capside. L'encart montre une moyenne de classe 2D de l'intermédiaire de libération du génome SU10. f Représentation schématique du segment du génome SU10 codant pour les protéines structurelles codées par la même couleur que les protéines des panneaux a à e. Les protéines représentées en blanc sont soit non structurelles, soit n'ont pas été identifiées dans les reconstructions.

Représentations de dessins animés de protéines formant la queue du virion SU10 a, c et de l'intermédiaire de libération du génome b, d. La protéine porte (gp6) est représentée en magenta, la protéine adaptatrice (gp11) en jaune, la protéine à fibre longue queue (gp12) en violet, la protéine à buse (gp17) en rouge, la protéine à fibre courte queue (gp16) en vert et l'aiguille de queue protéine (gp18) en bleu clair. vues a, b perpendiculaires à l'axe de la queue et vues c, d le long de l'axe de la queue vers la tête du phage. Dans le virion SU10, les fibres de la queue courte sont inclinées vers la capside et l'aiguille de la queue dépasse du complexe de la queue. L'intermédiaire de libération du génome de SU10 b, d n'a pas d'aiguille de queue et contient une buse de 277 Å de long formée par des fibres de queue courtes et des protéines de buse. L'aiguille de queue et le domaine central et de liaison au récepteur de la fibre de queue courte ont été modélisés à l'aide du multimère AlphaFold2 et intégrés à la carte cryo-EM. Les structures restantes ont été intégrées dans des reconstructions cryo-EM. Pour plus de détails sur la prédiction et la construction de la structure, veuillez consulter la section Matériaux et méthodes.

La capside prolate de SU10 est organisée avec une symétrie quintuple et est construite à partir de 715 copies de la principale protéine de capside organisée avec les paramètres de triangulation Tend = 4, Tmid = 20 (Fig. 3a, Fig. 1, 2 supplémentaires). La principale protéine de capside forme des capsomères de deux types : les pentamères et les hexamères. La partie tubulaire centrale de la capside est constituée de 90 hexamères disposés en neuf couches d'une hélice à dix entrées (Fig. 3a). La capside est fermée aux deux extrémités avec des coiffes formées par les protéines majeures de la capside organisées avec une symétrie quasi-icosaédrique T = 4 locale. La fermeture des capuchons est activée par des pentamères, qui sont courbés contrairement aux hexamères plus plats (Fig. 3a, Fig. 1 supplémentaire). Cependant, la formation de la tête prolate SU10 nécessite également une variation de la forme des hexamères et des angles auxquels ils interagissent. Les hexamères des coiffes sont plus courbés (H4, H5 ; 149-150°), alors que ceux qui forment la partie tubulaire de la capside sont relativement plats (H1, H2L, H2R, H3 ; ​​154–164°) (Fig. 2). Toutes les interfaces hexamère-hexamère et hexamère-pentamère dans les coiffes sont arquées (145 °) (Fig. 2A supplémentaire), cependant, les hexamères qui forment la partie tubulaire de la capside sont reliés par deux types d'interfaces, arquées (145 °) et plus plane (160°) (Fig. 2 supplémentaire). Les interfaces arquées permettent la formation d'anneaux d'hexamères, tandis que les plus planes médiatisent les interactions entre les anneaux (Fig. 2 supplémentaire).

a Représentation en dessin animé des protéines formant le virion du phage SU10. La capside allongée a une symétrie quintuple et les protéines de la capside sont organisées avec les paramètres de Tend = 4, Tmid = 20. Les pentamères des protéines de la capside sont représentés en orange, les hexamères en cyan foncé ou vert de mer clair. Les pentamères sont de deux types, en fonction de leur position dans la capside. Le pentamère P1 est positionné sur le quintuple axe de la particule, tandis que les pentamères P2 restants sont positionnés sur des axes quasi quintuples aux frontières entre la partie tubulaire de la capside et les coiffes. Il existe six variantes d'hexamères : H1 qui forment la partie centrale de la tête allongée ; H2L et H2R appartiennent à la partie centrale de la capside mais interagissent avec les coiffes terminales ; H3 sont entre les pentamères P2 ; H4 sont entre les pentamères P1 et P2 ; et H5 sont entre les pentamères P2 et le complexe porte. b Comparaison des structures des principales protéines de capside formant l'hexamère H1 (coloré selon les domaines) et le pentamère P1 (blanc). La principale protéine de capside de SU10 a un repliement HK9725,66. Les principales différences dans les structures des sous-unités P1 et H1 résident dans le bras N-terminal, la boucle étendue et la boucle annulaire. L'organisation du domaine de la principale protéine de capside est représentée par un tracé 1D. c Représentation en dessin animé des principales protéines de capside formant le pentamère P2 et l'hexamère H2R. Deux protéines de capside majeures qui interviennent dans la majorité des contacts entre le pentamère et l'hexamère sont présentées avec des domaines mis en évidence en couleur. Les sous-unités restantes sont représentées en alternance de blanc et de gris foncé. Les boucles G de toutes les sous-unités sont surlignées en magenta.

La principale protéine de capside de SU10 a un pli HK97, qui est courant chez les bactériophages à queue et les herpèsvirus (Fig. 3b)25. Selon la convention, la protéine de capside peut être divisée en bras N-terminal, domaine périphérique, boucle étendue, domaine axial et boucle riche en glycine (Fig. 3b). La principale différence entre les protéines de capside formant des hexamères et des pentamères réside dans la structure de la boucle annulaire positionnée à l'extrémité du domaine axial (Fig. 3b). Dans les hexamères, la boucle annulaire dépasse du domaine axial (Fig. 3b, c). Les six boucles annulaires des sous-unités formant un hexamère forment un anneau autour de son axe quasi sextuple (Fig. 3c). En revanche, dans les sous-unités formant des pentamères, la boucle annulaire est courbée à 90° vers le centre de la capside (Fig. 3c). Les brins bêta des boucles des principales protéines de capside d'un pentamère forment un barillet bêta avec un pore central d'un diamètre de 8 Å qui pénètre à travers la capside. (Fig. 3c, Fig. 3G supplémentaire). Le pore peut servir au passage des ions et des molécules d'eau depuis et dans la capside pendant l'empaquetage et l'éjection du génome.

Le génome de SU10 code pour une protéine (gp10) avec un pli de type immunoglobuline prédit similaire à celui de la protéine de capside mineure du phage Epsilon15 et le domaine N-terminal de la protéine de fibre de tête du bactériophage φ2926,27. Cependant, la reconstruction cryo-EM de la tête SU10 ne contient pas de densité correspondant aux protéines de capside mineures. Il est possible que la gp10 de SU10 ait une fonction différente ou se lie à la capside avec une faible affinité et ait été perdue lors de la purification du phage (Fig. 4C supplémentaire).

La densité cryo-EM du génome dans le virion SU10 a été résolue dans les reconstructions symétriques et asymétriques quintuples de sa tête (Fig. 1b, Fig. 3 supplémentaire). Malgré les différences dans les symétries imposées lors des processus de reconstruction, les arrangements des densités de génomes sont similaires (Fig. 3A – D supplémentaires). Neuf coquilles de densité peuvent être distinguées à l'intérieur de la partie tubulaire de la tête, alors que seules quatre coquilles sont résolues sous les calottes capsides (Fig. 3 supplémentaire). Dans les trois coquilles les plus externes, la densité se sépare en brins, qui peuvent être interprétés comme des segments d'ADN double brin (Fig. 3A – D, F supplémentaires). La structure résolue du génome dans la reconstruction cryo-EM indique que l'emballage du génome entraîne un ordre similaire de l'ADN dans la plupart des virions SU10. Cependant, les liens entre les segments d'ADN dans la partie centrale de la tête de SU10, qui doivent exister car le génome est formé d'un seul ADN2 double brin de 77 325 pb de long, ne sont pas résolus. Dans les reconstructions symétriques et asymétriques quintuples de la tête SU10, les brins d'ADN dans les deux couches les plus externes sont organisés en hélices à dix entrées (Fig. 3B, D supplémentaires). Les brins d'ADN de la couche la plus externe du génome se courbent pour éviter que les barils bêta ne dépassent des pentamères des protéines de capside (Fig. 3G supplémentaire). L'organisation intrigante de l'ADN peut être utilisée comme contrainte supplémentaire dans de futures études sur le processus d'encapsidation du génome du phage par des simulations informatiques.

Les protéines gp20-24 sont présentes dans le virion SU10, mais absentes de l'intermédiaire de libération du génome, ce qui indique qu'il s'agit de protéines d'éjection (Fig. 4C supplémentaire, Tableau supplémentaire 1). Cependant, la reconstruction du virion SU10 ne contient pas de densité résolue qui pourrait être attribuée aux protéines d'éjection putatives (Fig. 1b), comme c'est le cas dans les phages à queue T7, Epsilon15 et N417,18,28. Le génome de SU10 est empaqueté dans la capside avec une densité de 0,48 Da/Å3, ce qui est comparable aux 0,49–0,52 Da/Å3 déterminés précédemment pour les bactériophages P22, lambda, T4, ϕ29 et T729. Par conséquent, la capside de SU10 pourrait contenir à la fois de l'ADN génomique et des protéines d'éjection.

Le complexe porte de SU10 est intégré dans la capside à l'un de ses quintuples sommets, où il remplace un pentamère de protéines de capside (Figs. 1a, b, 4a). La protéine porte de SU10 peut être divisée en domaines d'aile, de tige, de clip, de couronne et de baril (Fig. 4b)29. Le domaine de l'aile est le plus grand et est formé de huit hélices et d'un sandwich β contenant deux feuillets β de cinq et trois brins β antiparallèles (Fig. 4b). Les chaînes latérales chargées positivement de Lys3 et Lys5 du domaine de l'aile interagissent avec l'ADN qui s'enroule autour du complexe portail (Fig. 4a). Les deux lysines sont répétées douze fois dans le complexe porte et forment ainsi une interface de haute avidité susceptible de se lier à l'ADN peu après le début de l'encapsidation du génome. L'ancrage de l'extrémité de l'ADN au portail influencerait l'empaquetage du génome dans la tête et sa structure finale. De plus, le domaine de l'aile assure la médiation des interactions du complexe porte avec la capside (Fig. 4a, c). En raison de l'inadéquation de la symétrie quintuple de la capside et de la symétrie douze fois du portail, nous avons caractérisé leurs interactions à l'aide d'une reconstruction asymétrique de la région du cou du virion SU10, qui a atteint une résolution de 4, 6 Å (tableau supplémentaire 2). Les résidus 8 à 44 du domaine de l'aile forment une hélice α incurvée qui tapisse la face interne de la capside (Fig. 4a, b). Des interactions supplémentaires entre le portail et la capside sont médiées par la boucle de tige du domaine de l'aile (Fig. 4a, b). La boucle de tunnel du domaine de l'aile rétrécit le canal portail de SU10 à 33 Å (Fig. 4, Fig. 5 supplémentaire). Dans les phages T7 et P23-45, il a été montré que les boucles tunnel ouvrent le canal porte et régulent ainsi la libération du génome15,30. Cependant, les boucles tunnel dans le virion SU10 et l'intermédiaire de libération du génome ont la même structure, il est donc probable qu'un mécanisme différent assure la rétention du génome de SU10 (Fig. 5 supplémentaire). Le domaine de la tige relie les domaines de l'aile et du clip et s'étend à travers la coque de la capside (Fig. 4b). Le domaine de clip du complexe portail s'étend de la capside et permet la fixation des protéines adaptatrices (Fig. 4a).

a Représentation de dessin animé du complexe portail intégré dans la capside. Une protéine porte est représentée en magenta et les sous-unités restantes en alternance de blanc et de gris. La densité cryo-EM de la capside est représentée en turquoise, et celle de l'ADN est représentée en gris. La densité d'une extrémité putative du génome dsDNA ou des protéines d'éjection à l'intérieur du corps du complexe portail est indiquée en orange. Les cartes de la capside et de l'ADN sont présentées à 2σ et 4σ, respectivement. b Représentation en dessin animé d'une sous-unité de la protéine portale colorée en fonction de la composition du domaine. L'organisation du domaine de la protéine portale est représentée par un tracé 1D. c Interactions du complexe portail avec la capside, vues le long de l'axe de la queue depuis l'extérieur de la particule. Les protéines portales sont représentées en alternance de rose et de violet, les protéines de capside sont représentées en turquoise foncé et clair. Les directions des hélices de la colonne vertébrale des domaines périphériques des principales protéines de la capside et des hélices N-terminales des domaines des ailes des protéines du portail sont mises en évidence par des flèches pour souligner le décalage entre la symétrie quintuple de la capside et la symétrie douze fois du portail.

Le dodécamère des protéines adaptatrices SU10 forme l'interface entre le dodécamère des protéines portailes et l'hexamère des protéines de la buse (Figs. 1c, 2a et 5). La protéine adaptatrice de SU10 a la même organisation de domaine que celles des phages T7 et KP32 : un domaine de faisceau d'hélice, un domaine de dock de fibre à longue queue et une boucle englobante (Fig. 5c)15. Une boucle englobante de protéine adaptatrice est coincée entre les domaines de clip d'une paire de protéines portales voisines et se lie aux boucles de tige de deux protéines portales supplémentaires positionnées dans le sens des aiguilles d'une montre lorsque l'on regarde le complexe portal de l'extérieur de la capside (Fig. 5f). Les domaines d'accueil des fibres à longue queue de deux protéines adaptatrices voisines diffèrent par leur structure car ils interagissent avec différentes parties d'une fibre à longue queue (Fig. 5a, b, d). Le domaine d'accueil des fibres à longue queue SU10 est similaire à ceux des phages T7 et KP32 (Fig. 6 supplémentaire) 15, 31, qui ont des fibres à longue queue 13, 32. En revanche, les protéines adaptatrices des phages P22 et Sf6, qui n'ont pas de fibres à longue queue, n'ont pas les domaines d'ancrage des fibres à longue queue (Fig. 6 supplémentaire) 12,27.

a, b Représentation en dessin animé d'un complexe adaptateur décoré de six longues fibres de queue vues le long et perpendiculairement à l'axe de la queue. Deux protéines adaptatrices sélectionnées du dodécamère sont surlignées en orange et jaune. Les sous-unités restantes sont représentées en alternance de blanc et de gris. Chacune des six fibres à longue queue est formée par un trimère de protéines gp12 (violette). c Superposition des structures de deux protéines adaptatrices voisines qui diffèrent par la conformation de leurs boucles d'ancrage de fibres à longue queue. L'une des protéines adaptatrices est colorée en fonction de la composition du domaine. La sous-unité superposée est représentée en blanc. L'organisation du domaine de la protéine adaptatrice est représentée par un tracé 1D. d Interactions des protéines adaptatrices avec la fibre longue queue. Les boucles de quai de fibre (vertes) de deux protéines adaptatrices voisines interagissent avec une fibre à longue queue. Les trois sous-unités qui forment la fibre à longue queue se différencient par des nuances de violet. L'extrémité N-terminale de chaque protéine de fibre à longue queue d'une fibre à longue queue forme des interactions uniques avec le complexe adaptateur. e Interactions du complexe adaptateur avec la capside vue le long de l'axe de la queue depuis l'extérieur de la particule. Les protéines adaptatrices sont présentées en alternance de jaune et d'orange, les protéines de capside sont présentées dans des tons de turquoise. Les directions des hélices de la colonne vertébrale à partir des domaines périphériques des principales protéines de capside et des boucles de dock de fibre des protéines adaptatrices sont indiquées par des flèches pour souligner le décalage de symétrie entre la capside et le complexe adaptateur. f Interface entre les protéines portailes et les boucles englobantes C-terminales des protéines adaptatrices. La boucle englobante (orange) passe entre les domaines du clip portail de la sous-unité portaile A (gris) et B (blanc), puis elle traverse la tige de la sous-unité portaile C (magenta foncé) et atteint entre la boucle d'aile (cyan) de la sous-unité C et tige de la sous-unité D (rose). Les protéines adaptatrices voisines diffèrent par les structures de leurs boucles englobantes. La boucle englobante (jaune) de la protéine adaptatrice avec l'autre conformation passe entre les domaines du clip portal des sous-unités portales B (blanc) et C (magenta foncé), puis traverse la tige de la sous-unité portale D (rose) et atteint entre le boucle alaire (bleu clair) de la sous-unité D (gris) et tige de la sous-unité E (rose).

Six fibres à longue queue sont attachées aux côtés du complexe adaptateur (Figs. 1a–c, 2a et 5a, b). La fibre longue queue de SU10 est formée de trimères de protéines proximales (gp12) et distales (gp13) de la fibre longue queue. Une fibre à longue queue se ramifie à partir du domaine du faisceau d'hélices de chaque sous-unité sur deux du complexe adaptateur (Figs. 2a, c et 5a, b). Les extrémités N-terminales de deux protéines proximales de fibres à longue queue d'une fibre s'étendent pour couvrir la surface du domaine du faisceau d'hélices de la protéine adaptatrice voisine située dans le sens antihoraire lorsque l'on regarde le complexe adaptateur de l'extérieur de la capside (Fig. 5b, d). L'extrémité N-terminale de la troisième protéine proximale de la fibre à longue queue se lie au domaine d'accueil de la fibre à longue queue de la protéine adaptatrice à partir de laquelle la fibre se ramifie (Fig. 5d). Les fibres à longue queue forment des contacts supplémentaires avec les boucles de dock de fibre qui dépassent radialement des domaines de dock de fibre des protéines adaptatrices (Fig. 5a, c, d). La partie enroulée-enroulée de chaque fibre à longue queue est maintenue par des boucles de dock de fibre de deux protéines adaptatrices voisines (Fig. 5a, d). La reconstruction cryo-EM de la queue a permis la construction de 90 résidus à partir de l'extrémité N-terminale de la protéine proximale de la fibre à longue queue de 786 résidus (Figs. 2a, c et 5a, b). Le reste de la fibre longue queue n'a pas été résolu, probablement à cause de sa flexibilité. Les micrographies électroniques de phages purifiés montrent que la longue fibre de la queue mesure 700 Å de long et contient une articulation coudée, qui divise la fibre en segments de 300 et 400 Å de long (Fig. 4a, b supplémentaires).

L'hexamère des protéines de la buse, attaché à l'adaptateur, est décoré de six fibres de queue courtes et son canal central est bouché avec une aiguille de queue (Figs. 1a – c, 2a, c et 6). Selon la convention établie pour le phage T715, la protéine de buse de SU10 peut être divisée en domaines de plate-forme, d'hélice bêta et de buse (Fig. 6a – c). Cependant, les protéines de buse de SU10 et T7 ne présentent aucune similarité de séquence détectable.

Représentation de dessin animé de l'hexamère des protéines de la buse avec des fibres de queue courtes attachées du virion SU10 vues de l'extérieur de la particule le long de (a) et perpendiculairement (b) à l'axe de la queue. Les protéines de la buse sont représentées en alternance de blanc et de gris, et les fibres de la queue courte en vert. L'une des protéines de la buse est mise en surbrillance en couleur, avec le domaine de la plate-forme en orange, le domaine de l'hélice bêta en bleu, le quai de fibre à queue courte en magenta et quatre domaines de la buse en rouge. La pointe de flèche noire dans le panneau (b) montre l'interaction du domaine de buse 4 et de la fibre de queue courte. c Comparaison des structures des protéines de la buse et des fibres à queue courte dans le virion SU10 et l'intermédiaire de libération du génome. La protéine de buse du virion est colorée comme dans les panneaux a et b, et les trois sous-unités gp16 formant une fibre à queue courte se distinguent par des nuances de vert. Les structures superposées de la protéine de buse et de la fibre de queue courte de l'intermédiaire de libération du génome sont représentées respectivement en blanc et en vert clair. L'organisation du domaine de la protéine de buse est représentée sous la forme d'un tracé 1D. d Comparaison des structures des domaines d'hélice bêta des protéines de buse du virion SU10 et de l'intermédiaire de libération du génome, représentés respectivement en couleurs arc-en-ciel et en blanc. Le domaine de l'hélice bêta à sept pales est de couleur arc-en-ciel de l'extrémité N-terminale en bleu à l'extrémité C-terminale en rouge. La boucle de quai de fibre à queue courte est une extension de la pale 1 (β1), tandis que les domaines de la buse sont insérés entre la pale 2 (β2) et la pale 3 (β3). e Interactions de la boucle de dock de fibre courte (magenta) avec trois protéines de fibre de queue courte (nuances de vert). Les chaînes latérales de Trp839, Trp847 et Trp857 de la boucle de quai à fibres courtes forment une étoile avec une symétrie quasi triple, ce qui permet la fixation de la fibre à queue courte, qui est un trimère. Les résidus Tyr23, Ile24 et Tyr25 de chaque protéine de fibre à queue courte serrent un segment de la boucle de dock de fibre avant chacun des tryptophanes.

Le domaine de la plate-forme a un pli bêta-sandwich avec les deux feuillets bêta formés respectivement par cinq et trois brins bêta (Fig. 6c). Le domaine de plate-forme de chaque protéine de buse interagit avec les domaines du faisceau d'hélices de deux protéines adaptatrices adjacentes. Les interactions distinctes des protéines de buse n'induisent que des différences minimes dans la structure des protéines adaptatrices voisines.

Le domaine de l'hélice bêta à sept pales a un diamètre de 50 Å et forme le noyau de la protéine de la buse (Fig. 6d). Les pales 4, 5 et 6 du domaine de l'hélice bêta bordent le canal de queue, tandis que les pales 1, 2 et 3 sont éloignées de l'axe de la queue. Le domaine de l'hélice bêta est interrompu par deux points d'entrée et de sortie de la chaîne principale polypeptidique, appelés ouvertures. La première ouverture dans la lame 1 comprend l'entrée de la chaîne principale depuis la partie N-terminale du domaine de plate-forme et la sortie de la chaîne principale vers la partie C-terminale du domaine de plate-forme (Fig. 6d). La structure de la pale 1 de l'hélice bêta est stabilisée par l'interaction antiparallèle du brin bêta le plus externe, qui est formé par les résidus C-terminaux du domaine, avec les brins restants formés par les résidus de l'extrémité N-terminale du domaine. , une fermeture dite velcro (Fig. 6d)33. La deuxième ouverture est causée par l'insertion de domaines de tuyère entre les pales 2 et 3 de l'hélice bêta (Fig. 6d). Des boucles dépassant des bords des lames 4 et 5 permettent le liage de l'aiguille de queue. Les boucles ont différentes conformations dans l'intermédiaire de libération du génome, ce qui entraîne l'élargissement du diamètre du canal de queue de 25 à 31 Å (Fig. 5 supplémentaire). La boucle d'amarrage de la fibre à queue courte est située au bord de la pale 1 du domaine de l'hélice bêta et permet la fixation d'une fibre à queue courte (Fig. 6c – e).

Dans le virion SU10, les domaines de buse de type Ig sont organisés en un arrangement en forme de L (Figs. 2a, 6a – c). Les deux premiers domaines de la buse forment une pointe émoussée de la queue, puis il y a un virage à 82° et les deux domaines restants pointent vers la capside (Fig. 6c). Les contacts entre les protéines de la buse sont médiés par les domaines de la plate-forme et de l'hélice bêta. De plus, les domaines de la buse s'enroulent autour de la queue et le domaine de la buse 1 interagit avec les domaines de la buse 2 et 3 de la protéine de la buse située dans le sens des aiguilles d'une montre lorsque l'on regarde la queue le long de son axe vers la capside (Fig. 6a, b). Le domaine de buse 4 interagit avec la boucle de dock de fibre à queue courte de la protéine de buse située dans le sens antihoraire (Fig. 6a, b). Les multiples interactions des domaines de la buse stabilisent la structure native de la queue SU10.

La fibre de queue courte de SU10 a une longueur de 210 Å, est droite et peut être divisée en domaines proximaux, centraux et de liaison aux récepteurs (Figs. 2, 6a – c, Fig. 7 supplémentaire). Le domaine proximal a été reconstruit à une résolution de 3, 8 Å, ce qui a permis la construction des 98 premiers résidus de gp16 (Fig. 6a – c, Fig. 7 supplémentaire). Les hélices alpha qui forment le domaine proximal sont interrompues par de courtes boucles qui interviennent dans l'échange des positions des hélices des sous-unités individuelles au sein du domaine (Fig. 7 supplémentaire). Les domaines central et de liaison au récepteur modélisés à l'aide du programme multimère AlphaFold2 pourraient être intégrés dans les reconstructions cryo-EM de résolution 7 et 15 Å, respectivement, avec un coefficient de corrélation dans l'espace réel de 0, 81 (Fig. 7A supplémentaire) 34 . Le domaine central est similaire à la pointe de la fibre à queue courte du phage T4 (PDB : 1PDI) (Fig. 7 supplémentaire)35,36, tandis que le domaine de liaison au récepteur ressemble à la pointe de la fibre à longue queue du phage T4 (PDB : 2XGF), qui reconnaît les lipopolysaccharides ou la protéine C porine de la membrane externe (Fig. 7 supplémentaire)36. De plus, les domaines central et de liaison au récepteur sont similaires aux parties correspondantes de la protéine de liaison au récepteur du bactériophage tempéré JUB59 (PDB: 6OV6) (Fig. 7 supplémentaire)37. La protéine de fibre à queue courte SU10 contient deux paires d'histidines (His194 et His196, His230 et His232), qui peuvent lier les ions Fe2+ et ainsi stabiliser la fibre, comme cela se produit dans T4 et JUB5936,37,38,39.

La fibre à queue courte est attachée à une boucle de quai de fibre à partir d'une protéine de buse (Fig. 6c, e). La boucle de quai de fibre contient des tryptophanes 839, 847 et 857, dont les chaînes latérales sont disposées selon une pseudo-symétrie triple (Fig. 6e). Chaque chaîne latérale de tryptophane forme des interactions hydrophobes avec Ile24 à partir de l'une des trois protéines de fibres à queue courte (Fig. 6e). De plus, les chaînes latérales de Tyr23, Ile24 et Tyr25 de chaque fibre à queue courte serrent un segment du polypeptide avant les tryptophanes de la boucle d'ancrage de la fibre (Fig. 6e). Les résidus 3 à 6 de la fibre de queue courte interagissent avec les résidus 303 à 308 du domaine de buse 4 de la protéine de buse située dans le sens des aiguilles d'une montre en regardant le long de l'axe de la queue vers la capside (Fig. 6b). La position de la fibre à queue courte est en outre stabilisée par l'interaction du domaine central de la fibre à queue courte avec les résidus 71 à 78 de la fibre à longue queue (Figs. 1c, 2a, c). Il est probable que la perturbation de ces interactions permette la coordination des changements conformationnels des fibres longues et courtes de la queue, ainsi que ceux des protéines de la buse, lors de la liaison de SU10 à la cellule hôte.

La structure de l'aiguille de queue SU10 avec une triple symétrie imposée a été reconstruite à une résolution de 15 Å (Figs. 1a – c, 2a, c, Fig. 8 supplémentaire). La structure de l'aiguille de queue, prédite par le multimère Alphafold2, peut être divisée en domaines coiled-coil et C-terminal, et pourrait être intégrée à la densité cryo-EM avec un coefficient de corrélation dans l'espace réel de 0, 80 (Fig. 8A supplémentaire, B). Le domaine de bobine enroulée de l'aiguille de queue SU10 est homologue à l'aiguille de queue du phage P2214, qui s'est avéré se plier jusqu'à 18°40. Par conséquent, nous nous attendons à ce que l'aiguille de queue de SU10 soit tout aussi flexible, ce qui peut être la raison pour laquelle nous n'avons pas pu la résoudre à une résolution élevée. Le domaine C-terminal a une structure de prisme bêta similaire à celle des pointes centrales de la queue des phages Myoviridae (Fig. 2a, c, Fig. Supplémentaire 8A, B)38,41,42. La liaison de l'aiguille de queue SU10 au canal de queue est activée par deux boucles sur la lame 4 et une boucle sur la lame 5 du domaine de l'hélice bêta des protéines de la buse (Fig. 8C, D supplémentaires). L'aiguille de queue de 260 Å de long dépasse de 200 Å du complexe de la buse (Figs. 1c, 2a, c).

La capside de l'intermédiaire de libération du génome de SU10 est identique à celle du virion (Fig. 1, Tableau supplémentaire 3). L'induction de la libération du génome SU10 in vitro par choc osmotique entraîne l'éjection incomplète de l'ADN du phage (Fig. 4 supplémentaire). La reconstruction de la tête de l'intermédiaire de libération du génome SU10 contient des anneaux de densité d'ADN putative attachés à la face interne de la capside (Fig. 1e, Fig. 9 supplémentaire). Même si la densité d'ADN dans la reconstruction de l'intermédiaire de libération du génome est organisée en anneaux, l'ADN restant à l'intérieur de la tête est très probablement un seul brin continu. Les anneaux sont des artefacts causés par la combinaison de la variabilité structurelle des segments d'ADN dans les particules individuelles et de leur désalignement au cours du processus de reconstruction. La propension de la capside SU10 à organiser les brins d'ADN, telle qu'observée dans l'intermédiaire de libération du génome, est susceptible d'influencer la structure du génome lors de l'encapsidation.

La reconstruction asymétrique du capuchon de capside sans queue contient une coquille sphérique de densité avec un diamètre extérieur de 80 Å et une épaisseur de paroi de 15 Å (Fig. 9C, E supplémentaires). Cette sphère de densité est également visible dans les moyennes de classe bidimensionnelle des intermédiaires de libération du génome (Fig. 9F supplémentaire). La sphère n'est pas centrée sur l'axe de symétrie quintuple de la capside, mais est reliée par une densité au tonneau bêta formé par des boucles annulaires des principales protéines de capside d'un pentamère (Fig. 9E supplémentaire). La position de la coquille sphérique de densité laisse un bord du pentamère accessible pour la liaison à l'ADN (Fig. 9C supplémentaire). La reconstruction asymétrique du virion SU10 ne contenait pas cette enveloppe sphérique de densité, cependant, il est possible que l'alignement asymétrique requis pour résoudre la structure de la sphère ait été empêché par le signal fort du génome. On ne sait pas ce qui forme la coquille sphérique de densité observée. Le rayon de la sphère est trop petit pour qu'elle soit formée par le dsDNA43 courbé. Par conséquent, il est probable que la coque sphérique soit formée de protéines.

La queue de l'intermédiaire de libération du génome SU10 est réorganisée dans la buse construite à partir de protéines de buse et de fibres de queue courtes (Figs. 2c, d, 6c, Fig. 5 supplémentaire, Film supplémentaire 1). Pour former la buse, les quatre domaines de la buse subissent un changement structurel important de la forme en L dans le virion SU10 à la disposition droite dans l'intermédiaire de libération du génome (Fig. 6c). Dans la nouvelle conformation, les quatre domaines forment une ligne s'éloignant du complexe portail. Alors que l'interaction de la boucle d'accueil de la fibre à queue courte avec une fibre à queue courte reste préservée, les connexions de la boucle de la fibre à queue courte au domaine de l'hélice bêta tournent l'une autour de l'autre et se plient à 135 ° pour s'éloigner de la tête du phage (Fig. 6c, d). La même rotation est effectuée par la fibre à queue courte. Dans le nouvel arrangement, les protéines de la buse et les fibres de la queue courte alternent pour former une buse qui prolonge la queue de 277 Å (Figs. 1d, 2b, d). De plus, la partie distale du domaine de l'hélice bêta de la protéine de la buse s'éloigne de 3 Å de l'axe de la queue, ce qui entraîne un élargissement du canal de la queue (Fig. 6c, Fig. 8C, D supplémentaire). La formation de la buse est nécessaire pour amener les domaines de liaison aux récepteurs des fibres à queue courte dans une position dans laquelle ils peuvent interagir avec la membrane externe d'E. coli.

Les tomogrammes d'E. coli infectés par SU10 démontrent que plusieurs phages peuvent se lier et délivrer leurs génomes dans une cellule (Fig. 7a, Fig. 10 supplémentaire, Film supplémentaire 2). Certains des phages n'étaient attachés que par de longues fibres de queue, tandis que les queues des phages restants formaient des buses (Fig. 7a, Fig. 10 supplémentaire). De plus, les phages avec des buses étaient à divers stades de libération du génome, des têtes pleines aux têtes vides. Les particules vides sont restées attachées à la surface de la cellule (Fig. 7a, Fig. 10D – F supplémentaire). Aux derniers stades de l'infection par SU10, l'échantillon contenait des vésicules de la membrane externe avec des particules de phage liées (Fig. 7a, Fig. 10J – L supplémentaire). Les vésicules membranaires peuvent être excrétées par des bactéries se développant en culture planctonique44,45,46. Dans les conditions de culture d'E. coli utilisées dans nos expériences, de nombreux virions descendants se sont assemblés dans les cellules infectées 45 à 65 minutes après l'infection (Fig. 10J – L supplémentaire). Les quelques particules initialement formées ont été distribuées au hasard, mais au fil du temps après l'infection, les virions descendants se sont assemblés en réseaux réguliers, comme cela a été décrit précédemment2.

un segment de cellule E. coli infectée 45 min après l'infection contient des phages SU10 à différents stades du cycle d'infection. Les virions à l'extérieur de la cellule sont représentés en turquoise, les intermédiaires de libération du génome avec des buses formées en bleu foncé, les particules vides en cyan et les virions descendants à l'intérieur de la cellule en rouge. Les membranes cellulaires internes et externes sont mises en évidence respectivement en orange foncé et en orange, les vésicules en orange clair, les ribosomes en bleu clair, le réseau de chimiorécepteurs en vert et le flagelle en violet. Les positions des particules de phage, des ribosomes (EMD-13270) et du réseau de chimiorécepteurs (EMD-10160) ont été identifiées à l'aide de l'appariement de modèles tel qu'implémenté dans EMclarity64,65, et les structures à haute résolution correspondantes ont été positionnées dans le tomogramme. b Schéma du virion SU10. c Mécanisme de fixation de SU10 et livraison du génome. (1) Le virion SU10 se fixe à la surface d'une cellule via des fibres à longue queue. (2) La liaison des six fibres à longue queue positionne le phage avec son axe longitudinal perpendiculaire à la membrane bactérienne. L'aiguille de la queue peut interagir avec la membrane externe. (3) Les fibres de la queue courte tournent vers la membrane cellulaire et les protéines de la buse se redressent pour former une buse. (4) L'aiguille de la queue se dissocie de la queue. Les protéines d'éjection sont libérées de la tête du phage, dégradent le peptidoglycane de la paroi cellulaire et étendent la buse du phage pour former un canal à travers le périplasme. L'éjection de l'ADN de SU10 dans le cytoplasme bactérien est initiée. (5) La particule vide reste associée à la cellule.

Les images confocales Airyscan de cellules E. coli avec des membranes et des génomes marqués, qui ont été infectées par SU10 avec de l'ADN marqué, ont vérifié que de nombreuses particules de phage se lient et délivrent leurs génomes dans une cellule (Fig. 10C – F supplémentaires). Le signal de fluorescence de l'ADN de phage marqué était détectable dans le cytoplasme cellulaire jusqu'à la lyse cellulaire, et il a même été incorporé dans les virions de la descendance (Fig. 10I, L supplémentaire). Les cellules infectées ont conservé leur unité de forme native 45 minutes après l'infection, mais à 65 minutes, elles ont perdu leur turgescence (Fig. 10J – L supplémentaire).

La liaison initiale du virion SU10 aux récepteurs de la membrane externe d'E. coli est médiée par des fibres à longue queue, qui ont des domaines de liaison aux récepteurs à leurs extrémités distales (Fig. 7b, c). Les structures du virion SU10 et de l'intermédiaire de libération du génome diffèrent dans la direction dans laquelle les fibres à longue queue s'éloignent des complexes adaptateurs (Fig. 2c, d). Les fibres à longue queue dans l'intermédiaire de libération du génome sont tournées de 6,6° par rapport à leur orientation dans le virion. Nous supposons que dans des conditions natives, ce changement conformationnel est induit par la liaison du phage à la membrane bactérienne. De plus, le mouvement des fibres à queue longue perturbe probablement leurs interactions avec les fibres à queue courte et les prépare ainsi à la formation de la buse de queue. La liaison des six fibres à longue queue SU10 aux récepteurs positionne le phage avec son axe longitudinal perpendiculaire à la membrane bactérienne (Fig. 7a, c). L'interaction putative de l'aiguille de la queue avec la membrane bactérienne déclenche des changements conformationnels des protéines de la buse, ce qui conduit à la perturbation de l'interaction du domaine de la buse quatre avec la fibre de la queue courte. En s'organisant en une ligne droite parallèle à l'axe de la queue, les domaines de la buse permettent à la rotation de 135° des fibres de la queue courte de s'éloigner de la tête du phage. Les fibres de la queue courte et les protéines de la buse alternent pour former une buse de 277 Å de long (Fig. 7c). La formation de la buse permet aux domaines prédits de liaison aux récepteurs des fibres à queue courte d'interagir avec les récepteurs à la surface cellulaire. La liaison des fibres de la queue courte aux récepteurs peut forcer l'aiguille de la queue, qui dépasse de la buse, à travers la membrane externe d'E. coli. Par la suite, l'aiguille de queue se dissocie de la queue pour permettre l'ouverture du canal de queue (Fig. 7c). Les protéines d'éjection sont probablement éjectées de la tête SU10 avant ou avec le début du génome. Les protéines d'éjection forment un canal de translocation à travers l'espace périplasmique et la protéine d'éjection gp20, avec une activité transglycosylase, dégrade le peptidoglycane de la paroi cellulaire. Le génome du phage est délivré au cytoplasme d'E. coli par un canal formé par la buse et le canal de translocation (Fig. 7c).

Le phage SU10 a été propagé sur la souche E. coli ECOR10, cultivée à 37 °C dans un bouillon nutritif (Oxoid). Le lysat de phage de 300 ml de culture bactérienne a été traité avec de la turbonucléase (Abnova) (concentration finale 5 unités / ml), centrifugé à 6000 x g pendant 20 min à 4 ° C et filtré à travers un filtre seringue en polyéthersulfone de 0, 45 μm. Les phages du filtrat ont été culottés par centrifugation à 54 000 x g pendant 2,5 h à 4 ° C dans un rotor 50,2 Ti (Beckman Coulter). Les culots de phages ont été dissous par incubation pendant une nuit dans 6 ml d'un tampon de phage (Tris-Cl 50 mM, NaCl 10 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0) à 4 °C. Les culots dissous ont été superposés sur un gradient de densité de CsCl (3 ml de chaque solution de CsCl dans un tampon de phage avec des densités de 1,45 g/ml, 1,50 g/ml et 1,70 g/ml) et centrifugés à 210 000 x g pendant 4 h à 12 °C à l'aide d'un rotor SW40Ti (Beckman Coulter). Les bandes contenant des particules de phage ont été recueillies à l'aide d'une aiguille et d'une seringue de calibre 0,8 mm. Le chlorure de césium a été éliminé par dialyse contre le tampon phage à 4 ° C pendant une nuit à l'aide d'un tube de dialyse Visking de type 8/32 ", 0, 05 mm d'épaisseur (pièce n ° 1780.1, Carl Roth, Allemagne).

L'échantillon de phage purifié (1012 PFU/ml) a été dilué 10 x en utilisant une solution d'urée 3 M dans le tampon de phage et incubé à 42° pendant 30 min. Après incubation, l'échantillon a été dilué 3x dans le tampon phage et traité avec de la turbonucléase (Abnova) à une concentration finale de 3,5 unités/ml pendant 15 min à température ambiante. Les particules de phage ont été culottées par centrifugation à 75 000 x g à 4 ° pendant 1 h dans un rotor 50,2 Ti (Beckman Coulter) et remises en suspension dans le tampon de phage. La composition protéique des virions SU10 et des intermédiaires de libération du génome a été comparée par électrophorèse sur gel SDS et analyse par spectrométrie de masse.

Le phage SU10 purifié a été remis en suspension dans du tampon Laemmli et bouilli pendant 3 min, puis l'échantillon a été traité avec de la turbonucléase à une concentration finale de 2 unités/ml (Abnova) pendant 15 min à température ambiante. Les protéines ont été séparées par électrophorèse sur gel à gradient de tricine. Toutes les principales bandes de protéines ont été coupées du gel et utilisées pour l'analyse par spectrométrie de masse. Le traitement et les analyses des données de spectrométrie de masse ont été effectués à l'aide du logiciel FlexAnalysis 3.4 et MS BioTools (Bruker Daltonics). Le logiciel Mascot (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni) a été utilisé pour les recherches de séquences dans les spectres MS/MS exportés par rapport à la base de données du National Center for Biotechnology Information et à une base de données locale fournie avec les séquences de protéines attendues. La tolérance de masse des peptides et des fragments MS/MS pour les recherches d'ions MS/MS était de 50 parties par million et 0,5 Da, respectivement. L'oxydation de la méthionine et la propionyl-amidation de la cystéine en tant que modifications facultatives et un clivage enzymatique ont été définis pour toutes les recherches. Les peptides avec un score peptidique statistiquement significatif (P < 0,05) ont été pris en compte.

Une solution de phage purifiée (4 μl) avec une concentration de 1012 PFU/ml a été pipetée sur une grille de cuivre trouée recouverte de carbone (R2/1, maille 200 ; Quantifoil), buvardée et vitrifiée en plongeant dans de l'éthane liquide à l'aide d'un FEI Vitrobot Mark IV . L'échantillon vitrifié a été transféré dans un microscope électronique Thermo Fisher Scientific Titan Krios fonctionnant dans des conditions cryogéniques et à une tension d'accélération de 300 kV. Le faisceau a été aligné pour un éclairage parallèle en mode NanoProbe, et des alignements sans coma ont été effectués pour supprimer l'inclinaison résiduelle du faisceau. Des micrographies de virions SU10 ont été recueillies à un grossissement de 59 000x sur un détecteur d'électrons direct Falcon III fonctionnant en mode linéaire, ce qui a donné une taille de pixel calibrée de 1,38 Å/pix. L'imagerie a été réalisée dans des conditions de faible dose (dose totale 49 e-/Å2) et des valeurs de défocalisation allant de -1,2 à -2,7 μm. L'exposition d'une seconde a été fractionnée en 40 images et enregistrée sous forme de film. L'ensemble de données des intermédiaires de libération du génome a été collecté à un grossissement de 105 000 x sur un détecteur d'électrons direct K2 Summit fonctionnant en mode comptage, ce qui a donné une taille de pixel calibrée de 1,34 Å/pix. L'imagerie a été réalisée dans des conditions de faible dose (dose totale 52 e-/Å2) et des valeurs de défocalisation allant de -1,2 à -2,7 μm. L'exposition de huit secondes a été fractionnée en 40 images et enregistrée sous forme de film. Les acquisitions de données automatisées ont été réalisées à l'aide du logiciel EPU (détecteur Falcon III) ou Serial EM (détecteur K2 Summit). Les films ont été corrigés en mouvement globalement et localement (patchs 5 × 5) à l'aide du logiciel MotionCor247 et enregistrés sous forme de micrographies pondérées en fonction de la dose. Les valeurs de défocalisation ont été estimées à partir de micrographies alignées non pondérées en fonction de la dose à l'aide du programme Gctf48.

Des grilles de virions SU10 préparées pour l'acquisition d'une seule particule ont été utilisées pour enregistrer des séries d'inclinaison de tomographie couvrant une plage angulaire de -60 ° à + 60 ° avec des incréments de 2 °, avec le schéma d'inclinaison bidirectionnel dans des conditions de faible dose à l'aide de SerialEM. Chaque série d'inclinaison a été collectée avec une valeur de défocalisation nominale de -6 µm. Chaque image a été acquise sous la forme d'un film de 7 images sur un détecteur Falcon II fonctionnant en mode comptage en utilisant une dose de 1 e-/Å2 par tilt. La dose cumulée totale pour chaque série d'inclinaison était de 57 e−/Å2. La taille de pixel calibré était de 1,8 Å. Les tomographies ont été reconstruites à l'aide d'eTomo du package IMOD49. Les sous-tomogrammes des têtes de virions SU10 ont été moyennés à l'aide du programme PEET50,51 du package IMOD avec symétrie D5 appliquée.

CrYOLO du progiciel SPHIRE neural network a été entraîné sur un sous-ensemble d'images de têtes de virions SU10 prélevées manuellement52. La sélection automatique finale a été effectuée sur 4 x micrographies regroupées à l'aide de crYOLO. Les coordonnées des particules résultantes ont été corrigées pour le facteur de regroupement, et des images de particules (taille de la boîte 1296 × 1296 pixels) ont été extraites des 9 000 micrographies originales non regroupées à l'aide de Relion53. Les particules ont été regroupées à 256 px (6,99 Å/pixel) en utilisant le regroupement d'espace réciproque tel qu'implémenté dans le progiciel Xmipp54. Plusieurs cycles de classification 2D ont été effectués dans Relion pour sélectionner des virions intacts à partir de l'ensemble de particules auto-cueillies. Le modèle initial de la tête SU10 à partir de la moyenne des sous-tomogrammes a été filtré passe-bas à une résolution de 30 Å. Plusieurs cycles de classification et de raffinement 3D avec symétrie C5 imposée ont été effectués à l'aide de Relion 3.1. Le progiciel Spider55 a été utilisé pour préparer un masque cylindrique excluant le génome du phage pour éviter que le signal du génome n'interfère avec la reconstruction de la capside. Après un auto-raffinement initial avec une symétrie C5 imposée, la classification 3D a été effectuée sans l'étape d'alignement. Les particules appartenant à la meilleure classe ont été sélectionnées pour un raffinement automatique Relion supplémentaire avec une symétrie C5 imposée et des écarts maximum autorisés par rapport aux orientations précédentes de 10°. Au fur et à mesure que la résolution de la reconstruction augmentait, les particules étaient progressivement dégroupées à 512 px (3,49 Å/pixel) et 1296 px (1,38 Å/pixel). La reconstruction symétrisée C5 finale a été masquée au seuil, divisée par la fonction de transfert de modulation et le facteur B a été accentué lors du post-traitement dans Relion 3.1. Pour améliorer encore la résolution de la capside, nous avons divisé la capside en capuchon symétrique C5 sans queue, partie centrale symétrique D10 et capuchon symétrique C5 avec queue. Toutes ces pièces ont été ré-extraites dans des boîtes plus petites, et leurs reconstructions ont été affinées à l'aide de recherches angulaires locales. Pour obtenir une reconstruction asymétrique de la queue du phage et de la capside environnante, une relaxation de symétrie de C5 à C1 a été réalisée à l'aide du programme relion_relax_symm (Fig. 11 supplémentaire).

Les orientations des particules de la reconstruction C5 de la tête du phage ont été utilisées pour extraire des images de sous-particules centrées sur les portails et les queues des virions SU10. Les images de sous-particules ont été soumises à plusieurs séries de classifications 2D, ce qui a permis la sélection d'ensembles de données homogènes. Après un auto-raffinement initial avec une symétrie C12 imposée pour le portail et des symétries C6 et C3 pour la queue, des classifications 3D ont été effectuées sans l'étape d'alignement. Les particules appartenant aux meilleures classes ont été sélectionnées pour un raffinement automatique Relion supplémentaire avec des symétries imposées et des écarts maximum autorisés par rapport aux orientations précédentes de 10°. Les cartes résultantes ont été masquées au seuil, divisées par la fonction de transfert de modulation et le facteur B affiné lors du post-traitement dans Relion (Fig. 11 supplémentaire).

Les orientations des particules de la reconstruction C6 de la queue du phage ont été utilisées pour extraire des images de sous-particules centrées sur l'aiguille de la queue du virion SU10. Les images de sous-particules ont été soumises à plusieurs séries de classifications 2D, ce qui a permis de sélectionner un jeu de données homogène. Après un auto-raffinement initial avec une symétrie relax définie sur C3, la classification 3D a été effectuée sans l'étape d'alignement. Les particules appartenant à la meilleure classe ont été sélectionnées pour un auto-raffinement Relion supplémentaire avec une symétrie C3 imposée et des écarts maximum autorisés par rapport aux orientations précédentes de 10 ° (Fig. 11 supplémentaire).

Pour obtenir une reconstruction asymétrique de l'ensemble du virion SU10, les orientations de la reconstruction de la tête symétrisée C5 ont été assouplies à l'aide de relion_relax_symm. Le progiciel Spider55 a été utilisé pour préparer un masque sphérique couvrant la queue du phage et 40 nm de la capside.

La reconstruction initiale a été effectuée sur des images de particules binées à 256 px (6,99 Å/pixel), en utilisant un facteur de régularisation élevé et en ne permettant que des recherches en rotation. La relaxation réussie de la symétrie a été vérifiée par la présence de caractéristiques biologiquement pertinentes dans les parties de la reconstruction appartenant à la fois à la tête et à la queue du phage. Par la suite, les reconstructions ont été poursuivies avec des données regroupées à 512 px (3, 49 Å / pixel) et 1296 px (1, 38 Å / pixel) (Fig. 11 supplémentaire).

Les intermédiaires de libération du génome SU10 ont été mis en boîte manuellement à l'aide d'e2boxer du progiciel EMAN256. Les coordonnées des particules résultantes ont été utilisées pour extraire les particules des 5688 micrographies à l'aide de Relion53,54. Les particules ont été regroupées à 256 px (6,99 Å/pixel) en utilisant le regroupement d'espace réciproque tel qu'implémenté dans le progiciel Xmipp54. Plusieurs cycles de classification 2D dans Relion ont été effectués pour sélectionner des intermédiaires de libération de génome intacts à partir de l'ensemble de particules. La reconstruction de la capside du virion SU10, filtrée passe-bas à une résolution de 30 Å, a été utilisée comme modèle initial pour la reconstruction 3D dans Relion. Plusieurs cycles de classification et de raffinement 3D avec symétrie C5 imposée ont été effectués à l'aide de Relion 3.1. La carte résultante a été masquée au seuil, divisée par la fonction de transfert de modulation et le facteur B a été accentué lors du post-traitement dans Relion (Fig. 12 supplémentaire).

Les orientations des particules de la reconstruction C5 de la capside de l'intermédiaire de libération du génome SU10 ont été utilisées pour extraire des images de sous-particules centrées sur les queues. Les images de sous-particules ont été soumises à plusieurs séries de classifications 2D, ce qui a permis de sélectionner un jeu de données homogène. Après un auto-raffinement initial avec une symétrie C6 imposée, la classification 3D a été effectuée sans l'étape d'alignement. Les particules appartenant à la meilleure classe ont été sélectionnées pour un autoraffinement Relion supplémentaire avec une symétrie C6 imposée et des écarts maximum autorisés par rapport aux orientations précédentes de 10°. La carte résultante a été masquée au seuil, divisée par la fonction de transfert de modulation et le facteur B a été accentué lors du post-traitement dans Relion (Fig. 12 supplémentaire).

Les orientations des particules de la reconstruction C5 de la capside de l'intermédiaire de libération du génome SU10 ont été utilisées pour extraire des images de sous-particules centrées sur les sommets des capsides. Les images de sous-particules ont été soumises à plusieurs séries de classifications 2D, ce qui a permis de sélectionner un jeu de données homogène. Les particules ont été élargies en symétrie C5 et une classification 3D en dix classes a été effectuée sans l'étape d'alignement. Les particules appartenant aux meilleures classes ont été sélectionnées et les doublons de particules issus de l'expansion de symétrie ont été supprimés. Les particules résultantes ont été utilisées pour un autoraffinement Relion supplémentaire sans symétrie et avec des écarts maximum autorisés par rapport aux orientations précédentes de 10 ° (Fig. 12 supplémentaire).

Les structures PDB ont été construites à l'aide du programme COOT47 (protéine portaile, protéine adaptatrice, résidus 1-90 de la fibre à longue queue et domaine proximal de la fibre à queue courte), construites automatiquement à l'aide de Deep Tracer57 (protéine de la buse) ou modélisées à l'aide d'Alphafold234 (protéine centrale et récepteur -domaines de liaison de la fibre de queue courte et de l'aiguille de queue). Les structures ont été affinées itérativement dans l'espace réel à l'aide du programme PHENIX real_space_refine.py58 et corrigées manuellement dans COOT47 et ISOLDE59. La qualité des structures et leur adaptation aux cartes de densité cryo-EM ont été évaluées à l'aide d'une validation complète dans le programme PHENIX. Les courbes FSC des reconstructions cryo-EM sont présentées dans la Fig. 13 supplémentaire. Un modèle pour cartographier les courbes FSC de structures individuelles et des exemples d'ajustement des modèles PDB aux densités cryo-EM sont présentés dans la Fig. 14 supplémentaire.

Les structures des protéines SU10 qui n'ont pas été résolues dans les reconstructions cryo-EM à une résolution suffisante pour permettre la détermination structurelle ont été prédites à l'aide d'une installation locale du multimère AlphaFold 2.1.2. Le logiciel a été installé à partir de https://github.com/deepmind/alphafold, en utilisant un environnement Dockerisé. Pour la prédiction, les bases de données recommandées par les auteurs d'AlphaFold au moment de l'installation (hiver 2021), ont été utilisées (BFD, MGnify, PDB70, PDB, PDB seqres, Uniclust30, UniProt, UniRef90)34.

La carte composite du virion SU10 a été préparée en combinant des segments de reconstructions de sous-particules des régions du virion SU10. Des reconstructions de sous-particules de régions du virion SU10 ont été intégrées dans la reconstruction asymétrique du virion SU10 complet à l'aide de Chimera60, 61, 62 (la commande Fit in Map). La carte composite a été construite à partir des reconstructions suivantes : reconstruction capside symétrisée C5 ; portail de reconstruction du cou symétrisé C12 ; adaptateur, fibres à longue queue, buse et fibres à queue courte à partir d'une reconstruction de queue symétrisée C6 ; et reconstruction de l'aiguille de queue symétrisée C3. Des segments de reconstructions de sous-particules ont été combinés dans la carte composite en utilisant la procédure suivante : (1) Des masques couvrant les structures PDB des protéines constitutives ont été générés à l'aide de pdb2mrc. (2) Les masques ont été étendus de six voxels et de quatre voxels supplémentaires de bord doux (Relion3 - relion_mask_create). (3) Les reconstructions de sous-particules ont été multipliées par les masques correspondants (Relion3 - relion_image_handler). (4) Pour chaque seuil de segment, la structure de l'ensemble du composant avec un maximum de détails résolus a été sélectionnée pour l'affichage. Pour une carte de fibre à queue courte avec une résolution décroissante le long de la fibre, trois segments avec des seuils différents ont été sélectionnés. (5) Les cartes des segments ont été normalisées à l'aide du masque de carte CCP4. (6) Les segments normalisés ont été combinés dans la carte composite finale à l'aide de la commande Chimera vop add onGrid. La carte composite de l'intermédiaire de libération du génome SU10 a été préparée en utilisant la même procédure à partir de la capside reconstruite avec une symétrie C5 et de la queue reconstruite avec une symétrie C6.

Une culture à croissance exponentielle de E. coli ECOR10 (DO = 0,3) a été infectée avec le bactériophage SU10 (MOI = 10) pré-coloré avec DmaO (BIOTIUM) en présence de 0,002 M CaCl2. L'infection a été réalisée dans une lame de culture cellulaire PS 75/25 mm avec un fond en verre (Greiner bio-one) à 37 ° C, sous agitation à 100 tr/min et laissée se poursuivre pendant 5, 25, 45 et 65 min. Les membranes bactériennes et l'ADN ont été colorés avec SynaptoRed (BIOTIUM) (concentration finale 4 μM) et DAPI (Roche) (concentration finale 300 nM). Pour l'imagerie, les échantillons ont été fixés avec un mélange de glutaraldéhyde et de formaldéhyde (0,125% et 4%, respectivement) dans un tampon phosphate 50 mM (pH = 7,5). Pour empêcher le mouvement pendant l'imagerie, les échantillons ont été recouverts d'agarose à bas point de fusion à 1 % dans le tampon de phage.

Les échantillons ont été imagés à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM 880 avec Airyscan en mode RS, avec excitation de fluorophore aux longueurs d'onde suivantes : DAPI à 405 nm, DmaO à 488 nm et SynaptoRed à 514 nm. Les données ont été traitées à l'aide de ZEN Black et visualisées à l'aide de Fiji63.

Une culture à croissance exponentielle de E. coli ECOR10 (DO = 0,3) a été infectée par le bactériophage SU10 (MOI = 10). On a laissé l'infection progresser pendant 5, 25, 45 et 65 min. 1,5 ml de culture bactérienne infectée a été culotté par centrifugation à 10 000 x g pendant 1 min à 4°. Les culots ont été remis en suspension dans 15 µl de tampon de phage et conservés sur de la glace. Des marqueurs fiduciaires en or (billes de 10 nm) ont été appliqués sur la grille de cuivre trouée revêtue de carbone (R3, 5 / 1, maille 200; Quantifoil) pour la microscopie électronique, recouverte de papier filtre et immédiatement recouverte de 4 μl de suspension cellulaire. Par la suite, les grilles ont été buvées et vitrifiées par immersion dans de l'éthane liquide à l'aide d'un Vitrobot Mark IV. Des séries d'inclinaisons tomographiques couvrant une plage angulaire de −60° à +60° avec des incréments de 3° ont été enregistrées automatiquement à l'aide d'un schéma d'inclinaison dose-symétrique dans des conditions de faible dose sur un détecteur d'électrons direct K2 Summit, positionné derrière le filtre d'énergie dans le Titan Microscope Krios. Chaque série d'inclinaison a été collectée avec une valeur de défocalisation nominale de -6 µm et acquise sous la forme d'un film contenant 5 images en mode comptage du détecteur, en utilisant une dose de 2 e-/Å2 par inclinaison. La dose cumulée totale pour chaque série d'inclinaison était de 57 e−/Å2. La taille de pixel calibré était de 4,33 Å. Les tomogrammes ont été reconstruits et visualisés à l'aide d'IMOD du progiciel eTomo58. Les membranes et les flagelles ont été segmentés à l'aide du programme Amira64. Les positions des particules de phage, des ribosomes (EMD-13270) et du réseau de chimiorécepteurs (EMD-10160) ont été identifiées à l'aide de la correspondance de modèles telle qu'implémentée dans EMclarity64,65, et les structures à haute résolution correspondantes ont été positionnées dans le tomogramme à l'aide de scripts internes. https://github.com/fuzikt/tomostarpy.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les reconstructions cryo-EM et les structures PDB correspondantes ont été déposées sous les codes EMDB et PDB suivants : Structures du virion SU10 : capside à symétrie quintuple EMD-14488 et PDB-7Z49, reconstruction de capside asymétrique EMD-14492 et PDB-7Z4B, capside top EMD -14485 et PDB-7Z46, centre de la capside EMD-14484 et PDB-7Z45, fond de la capside EMD-14487 et PDB-7Z48, reconstruction asymétrique du fond et de la queue de la capside EMD-14489 et PDB-7Z4A, col à symétrie douze fois EMD-14483 et PDB-7Z44, queue à symétrie sextuple EMD-14486 et PDB-7Z47, aiguille de queue à symétrie triple EMD-14909 et carte composite de l'ensemble du virion EMD-14977. Structures de l'intermédiaire de libération du génome : capside à symétrie quintuple EMD-14490, queue à symétrie sextuple EMD-14495 et PDB-7Z4F, capside supérieure EMD-14491 et carte composite de l'intermédiaire de libération du génome entier EMD-14920.

Les scripts de positionnement des structures haute résolution dans les tomogrammes sont disponibles sur https://github.com/fuzikt/tomostarpy.

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Nous remercions CEITEC MU Cryo-electron microscopy and tomography core facility et Proteomics Core Facility of CIISB, Instruct-CZ Center soutenu par MEYS CR (LM2018127) pour leur aide à l'obtention des données scientifiques présentées ici. Nous reconnaissons l'installation centrale CELLIM soutenue par le grand projet RI Czech-BioImaging (LM2018129 financé par MEYS CR) pour son soutien à l'obtention des données scientifiques présentées dans cet article. Nous apprécions grandement l'accès aux installations de calcul et de stockage appartenant aux parties et aux projets contribuant au National Grid Infrastructure MetaCentrum, fourni dans le cadre du programme Projets de grande infrastructure pour la recherche, le développement et les innovations (LM2010005). Cette étude a été soutenue par le Centre d'excellence IT4Innovations (projet CZ.1.05/1.1.00/02.0070). Ce travail, y compris les efforts de Pavel Plevka, a été financé par la subvention LL1906 Consolidator ERC-CZ du ministère tchèque de l'Éducation, de la Jeunesse et des Sports, la subvention GA18-17810S de la Fondation tchèque des sciences et le projet Institut national de virologie et de bactériologie (Programme EXCELES, ID Projet n° LX22NPO5103) - Financé par l'Union européenne - Next Generation EU. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'interprétation des données, ou la décision de soumettre le travail pour publication.

Institut de technologie d'Europe centrale, Kamenice 753/5, 625 00, Brno, République tchèque

Marta Šiborová, Tibor Füzik, Michaela Procházková, Jiří Nováček & Pavel Plevka

Faculté des sciences, Université Masaryk, Kamenice 753/5, 625 00, Brno, République tchèque

Martin Benešík

Département des biosciences moléculaires, Institut Wenner-Gren, Université de Stockholm, 106 91, Stockholm, Suède

Anders S. Nilsson

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Conceptualisation PP ; méthodologie M.Š., TF, MP, JN et MB ; validation M.Š. et TF ; analyse formelle M.Š., MP, JN et MB ; enquête M.Š., MP, JN et MB ; ressources AN ; conservation des données M.Š. et TF ; rédaction—préparation du projet original M.Š., TF et PP ; rédaction—révision et édition M.Š., TF et PP; visualisation M.Š. et TF ; supervision PP ; financement acquisition PP

Correspondance à Pavel Plevka.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Šiborová, M., Füzik, T., Procházková, M. et al. Les protéines de queue du phage SU10 se réorganisent dans la buse pour la livraison du génome. Nat Commun 13, 5622 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33305-w

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Reçu : 31 janvier 2022

Accepté : 12 septembre 2022

Publié: 24 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-33305-w

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