Métagénomique

Nature Microbiology volume 8, pages 1108–1122 (2023)Citer cet article

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Les morbillivirus sont parmi les pathogènes viraux les plus contagieux des mammifères. Bien que des études métagénomiques antérieures aient identifié des séquences de morbillivirus chez les chauves-souris, les morbillivirus complets des chauves-souris sont limités. Nous caractérisons ici le myotis bat morbillivirus (MBaMV) d'un programme de surveillance des chauves-souris au Brésil, dont le génome complet a été récemment publié. Nous démontrons que la protéine de fusion et de liaison au récepteur de MBaMV utilise le CD150 de chauve-souris et non le CD150 humain, comme récepteur d'entrée dans une lignée cellulaire de mammifère. En utilisant la génétique inverse, nous avons produit un clone de MBaMV qui a infecté des cellules Vero exprimant le CD150 de chauve-souris. La microscopie électronique de cellules infectées par MBaMV a révélé le bourgeonnement de virions pléomorphes, une caractéristique morbillivirale caractéristique. La réplication du MBaMV a atteint 103 à 105 unités formant plaque ml-1 dans les lignées cellulaires épithéliales humaines et dépendait de la nectine-4. L'infection des macrophages humains s'est également produite, quoique 2 à 10 fois moins efficacement que le virus de la rougeole. Il est important de noter que le MBaMV est limité par la neutralisation croisée des sérums humains provoqués par la vaccination contre la rougeole, les oreillons et la rubéole et est inhibé par les inhibiteurs de la polymérase biodisponibles par voie orale in vitro. Les gènes P/V codés par MBaMV n'ont pas antagonisé l'induction de l'interféron humain. Enfin, nous montrons que le MBaMV ne provoque pas de maladie chez les roussettes jamaïcaines. Nous concluons que, bien que la propagation zoonotique chez l'homme puisse théoriquement être plausible, la réplication du MBaMV serait probablement contrôlée par le système immunitaire humain.

Les chauves-souris sont des hôtes réservoirs importants pour de nombreux virus à potentiel zoonotique1. Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère, le virus Ebola et le virus Nipah sont des exemples de ces virus qui ont provoqué des épidémies et des pandémies mortelles lorsqu'ils se sont propagés des chauves-souris aux populations humaines et animales2,3. Une surveillance attentive des virus chez les chauves-souris est essentielle pour identifier les pathogènes zoonotiques potentiels. Cependant, les enquêtes métagénomiques chez les chauves-souris n'aboutissent souvent pas à des séquences virales complètes pouvant être utilisées pour régénérer ces virus pour une caractérisation ciblée4, du moins pas sans beaucoup d'efforts supplémentaires comme l'amplification rapide en 3 'et 5' des extrémités d'ADN complémentaires. Les améliorations des technologies de séquençage et de la bioinformatique ont permis des assemblages de génomes plus complets. Trois enquêtes métagénomiques publiées au cours de la dernière année confirment que les chauves-souris, et dans une moindre mesure les musaraignes et les rongeurs, sont les hôtes de divers paramyxovirus5,6,7 qui comprennent plusieurs genres (Jeilongvirus, Morbillivirus et Henipavirus). Les séquences métagénomiques, aussi complètes soient-elles, ne permettent pas à l'heure actuelle d'apporter des informations suffisamment précises sur les phénotypes viraux in vitro et in vivo. Des investigations virologiques détaillées sont encore nécessaires pour réifier les découvertes taxonomiques.

Les morbillivirus sont parmi les pathogènes viraux les plus contagieux qui infectent les mammifères. Alors que de nombreuses séquences partielles de morbillivirus ont été identifiées chez les chauves-souris et les rongeurs4,5 lors d'enquêtes métagénomiques, aucun morbillivirus authentique de pleine longueur n'a été isolé ou caractérisé à partir d'hôtes chiroptères. Le genre morbillivirus comprend le virus de la rougeole (MeV), le virus de la maladie de Carré canine (CDV), le virus de la peste bovine, le virus de la maladie de Carré phocine, le morbillivirus des cétacés, le virus de la peste des petis ruminants et le morbillivirus félin8. Un morbillivirus porcin a récemment été décrit comme étant la cause présumée de mort fœtale et d'encéphalite chez le porc9. Tous les morbillivirus provoquent une maladie grave chez leurs hôtes naturels10,11,12,13,14, et la pathogénicité est largement déterminée par l'expression spécifique à l'espèce des récepteurs canoniques des morbillivirus, codés par CD150/SLAMF1 (réf. 15) et NECTIN4 (réf. 16) .

Dans cet article, nous caractérisons le morbillivirus de la chauve-souris myotis (MBaMV) d'une espèce de chauve-souris vespertilionide (Myotis riparius) au Brésil, précédemment identifiée uniquement à partir des informations de séquence uniquement. MBaMV a utilisé Myotis spp. CD150 bien meilleur que le CD150 humain et chien dans les tests de fusion. Nous l'avons confirmé en utilisant un MBaMV vivant qui a été sauvé par génétique inverse. Étonnamment, le MBaMV s'est répliqué dans les cellules myéloïdes humaines primaires mais pas dans les cellules lymphoïdes et l'a fait de manière indépendante de CD150. Cela contraste avec le MeV, qui est connu pour infecter les cellules myéloïdes et lymphoïdes humaines CD150+. De plus, le MBaMV s'est répliqué dans les cellules épithéliales humaines et a utilisé la nectine-4 humaine presque aussi bien que le MeV. Néanmoins, le MBaMV P/V ne semble pas s'opposer aux voies d'induction et de signalisation de l'interféron humain (IFN), et le MBaMV a été neutralisé de manière croisée, bien qu'à des degrés variables, par les sérums des vaccinés contre la rougeole, les oreillons et la rubéole (ROR). Nos résultats démontrent la capacité du MBaMV à infecter et à se répliquer dans certaines cellules humaines essentielles à la pathogenèse et à la transmission du MeV. Pourtant, une évaluation complète des caractéristiques virales fournit des données pour une évaluation correcte de son potentiel zoonotique.

Au cours d'une étude génomique métagénomique des virus chez les chauves-souris, nous avons identifié une séquence complète de morbillivirus provenant d'une chauve-souris myotis riveraine (M. riparius) au Brésil7. Au total, 46 individus ont été échantillonnés de l'espèce M. riparius. Parmi ceux-ci, 9 ont été échantillonnés dans la région amazonienne et 37 dans la forêt atlantique du sud du Brésil. Le prélèvement rectal d'un individu de la région amazonienne était positif pour le virus PDF-31377. Ce MBaMV avait une longueur de génome de 15 720 nucléotides conformes à la règle de 6 et était composé de 6 unités transcriptionnelles codant pour les cadres de lecture ouverts (ORF) canoniques de la protéine nucléo (N), de la protéine phospho (P), de la protéine matrice (M), protéine de fusion (F), protéine de liaison au récepteur (RBP) et grande protéine (L) (Extended Data Fig. 1a). Les tailles de ces ORF sont comparables à celles de leurs homologues dans les autres morbillivirus (Extended Data Table 1). L'analyse phylogénétique utilisant la séquence complète de la protéine L a indiqué que MBaMV est le plus étroitement lié au CDV et au virus de la maladie de Carré phocine (données étendues Fig. 1b et tableau de données étendu 2).

Les protéines de paramyxovirus ayant les interactions les plus fréquentes et les plus directes avec les protéines de l'hôte, telles que P et ses produits géniques accessoires (V et C) ainsi que la RBP, ont tendance à présenter la plus grande diversité17. Les morbillivirus P, V et C antagonisent les réponses immunitaires innées spécifiques à l'hôte, tandis que sa RBP interagit avec les récepteurs spécifiques à l'hôte. Le fait que ces protéines subissent une pression évolutive pour interagir avec différentes protéines hôtes se reflète dans la plus faible conservation de MBaMV P/V/C (31–43 %) et de RBP (27–32 %) avec d'autres homologues de morbillivirus. Cela contraste avec la conservation relativement élevée (52 à 76 %) des protéines MBaMV N, M, F et L avec leurs homologues morbillivirus respectifs (Extended Data Fig. 2).

L'utilisation de CD150/SLAMF1 pour pénétrer dans les cellules myéloïdes et lymphoïdes est une caractéristique des morbillivirus, ainsi qu'un déterminant majeur de la pathogénicité. Le CD150 est très divergent d'une espèce à l'autre et explique le tropisme restreint à l'espèce de la plupart des morbillivirus18. Ainsi, nous avons d'abord caractérisé le tropisme des récepteurs spécifiques à l'espèce du MBaMV. Nous avons effectué un test de fusion quantitatif basé sur l'image en co-transfectant des vecteurs d'expression codant MBaMV-F et MBaMV-RBP, ainsi que CD150 de l'espèce indiquée dans des cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) négatives pour les récepteurs. MeV-RBP et F ont formé plus de syncytia dans les cellules CHO lors de la co-transfection humaine-CD150 (hCD150) par rapport au chien CD150 (dCD150) ou à la chauve-souris CD150 (bCD150) (Fig. 1a, rangée du haut). En revanche, MBaMV-RBP et F ont formé des syncytia plus gros et plus nombreux lors de la surexpression de bCD150 que hCD150 ou dCD150 (Fig. 1a, rangée du milieu). CDV-RBP et F ont formé des syncytia étendus avec dCD150 et bCD150, et des syncytia modérés avec hCD150 et même des cellules transfectées fictives (Fig. 1a, rangée du bas), suggérant un degré de promiscuité. Nous avons quantifié ces résultats différentiels de formation de syncytia sur un cytomètre d'image comme décrit19 (Fig. 1b).

a, Formation de syncytia dans des cellules CHO co-transfectées avec les glycoprotéines d'enveloppe de morbillivirus indiquées, CD150 spécifique à l'espèce et Life-act-GFP. Les images ont été prises par le Celigo Imaging Cytometer (Nexcelom) à 48 h après la transfection (hpt) et sont des composites informatiques à partir d'un nombre identique de champs dans chaque puits. Barres d'échelle, 200 µm. Les paramètres de luminosité et de contraste étaient identiques. b, Quantification de la formation de syncytia dans a. Les données sont moyennes ± sd de trois expériences indépendantes. Les valeurs P ajustées indiquées proviennent d'une ANOVA unidirectionnelle ordinaire avec le test de comparaisons multiples de Dunnett. c, le test d'entrée de pseudo-particules VSV (pp) a montré des tendances similaires. Valeurs P ajustées obtenues comme en b mais uniquement pour comparer les groupes à l'inoculum viral le plus élevé utilisé (dilution réciproque 10-1) dans trois expériences biologiquement indépendantes (moyenne ± sd).

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Nous avons également évalué l'utilisation des récepteurs du MBaMV dans un essai d'entrée de pseudotype du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV). VSV-DG [Rluc] portant MeV-RBP et F sont mieux entrés dans les cellules CHO transfectées par hCD150 que les cellules transfectées par dCD150, bCD150 ou factices (Fig. 1c), comme prévu. Les pseudotypes MBaMV n'entraient que dans les cellules CHO transfectées par bCD150. Les pseudotypes CDV ont montré une bonne entrée dans les cellules CHO transfectées par dCD150 et bCD150 mais pas transfectées par hCD150. Ces résultats sont généralement cohérents avec nos résultats de test de fusion et appuient la spécificité d'espèce des morbillivirus. Le CDV a une forte propension à traverser les barrières d'espèces et peut provoquer des maladies chez plusieurs familles de carnivores telles que les grands félidés (par exemple, les lions et les tigres), les hyénidés (par exemple, les hyènes tachetées), les ailuridés (par exemple, les pandas roux), les ursidés ( par exemple, les ours noirs), les procyonidés (par exemple, les ratons laveurs), les mustélidés (par exemple, les furets), les viverridés (par exemple, les civettes) et même des espèces non carnivores telles que les javalinas (pécaris) et les rongeurs (marmottes asiatiques)20. Le CDV a également été impliqué dans de multiples épidémies chez des primates non humains (diverses espèces de Macaca)21,22,23. La capacité du CDV à utiliser bCD150 et dCD150 avec une efficacité égale suggère un potentiel de transmission efficace des carnivores à certaines espèces de chiroptères si d'autres facteurs post-entrée ne présentent pas de restrictions supplémentaires.

Ensuite, nous avons tenté de générer un clone d'ADNc génomique de MBaMV que nous pourrions récupérer par génétique inverse. Nous avons synthétisé et assemblé le génome putatif de MBaMV en fragments de plus en plus grands. Deux mutations silencieuses ont été introduites dans le 1,5 kb N-terminal du gène L pour perturber un ORF cryptique dans le brin moins (Extended Data Fig. 3) qui empêchait initialement le clonage de l'ensemble du génome du MBaMV. Nous avons introduit une unité de transcription EGFP supplémentaire à l'extrémité 3 'et sauvé ce génome MBaMV-GFP à l'aide du plasmide accessoire N, P et L de MeV (Extended Data Fig. 1a). MBaMV-GFP a été initialement sauvé dans des cellules BSR-T7 mais passé, amplifié et titré sur des cellules Vero-bCD150 (Extended Data Fig. 4a). MBaMV a formé des syncytia GFP-positifs contenant des centaines de noyaux 3 jours après l'infection (dpi) (Fig. 2a) et des plaques relativement homogènes à 7 dpi (Fig. 2b). La microscopie électronique à transmission (TEM) (Fig. 2c) a capturé de nombreux virions pléiomorphes (~ 100–200 nm) associés ou bourgeonnant à partir de cellules Vero-bCD150. Certains semblent être des particules filamenteuses émergeant d'une cellule. A fort grossissement, les virions étaient délimités par des saillies suggérant des glycoprotéines de surface. Des structures de type ribonucléoprotéine peuvent être trouvées à l'intérieur du virion illustré. Ces observations sont cohérentes avec les découvertes précédentes de MeV24.

a, Formation de syncytia dans les cellules Vero-bCD150 induite par MBaMV 3 dpi Les cellules ont formé des syncytia impliquant> 100 noyaux lors de l'infection (champ clair), ce qui est clairement défini par la GFP exprimée par le virus (à droite). Barres d'échelle, 500 µm. Cette expérience a été réalisée trois fois et des images représentatives sont représentées. b, formation de plaques MBaMV dans des cellules Vero-bCD150. Les cellules ont été infectées par un stock de virus dilué en série dix fois, incubées avec du DMEM contenant de la méthylcellulose et colorées avec du cristal violet et du rouge neutre 7 dpi Le diamètre du puits est de 22 mm. Un puits est agrandi pour montrer la morphologie de la plaque en détail. c, images TEM du virion MBaMV à la surface de cellules Vero-bCD150 à 3 dpi De nombreux virions enveloppés bourgeonnent ou sont associés à la membrane plasmique (à gauche). Des particules filamenteuses sont également visibles (astérisques). L'image agrandie (à droite) montre le virion et le complexe ribonucléoprotéique (RNP). Ces images proviennent d'une expérience indépendante.

Pour comprendre dans quelle mesure le CD150 de divers hôtes supporte la réplication du MBaMV, nous avons testé la croissance du MBaMV dans les cellules parentales Vero-CCL81 et les dérivés isogéniques exprimant de manière constitutive le CD150 de l'homme, du chien ou de la chauve-souris. MBaMV a formé d'énormes syncytia (Fig. 3a) à 2 dpi dans des cellules Vero-bCD150 et a atteint des titres maximaux d'environ 105 PFU ml-1 à 3 dpi (Fig. 3b). MBaMV a montré une propagation et une croissance modérées des syncytia dans les cellules Vero-dCD150, mais les titres maximaux à 5 dpi étaient environ 100 fois plus faibles. Aucune croissance virale notable n'a été détectée dans les cellules Vero ou Vero-hCD150. Ces résultats confirment que MBaMV peut utiliser bCD150 mais pas hCD150 pour une entrée et une réplication efficaces dans les cellules. MBaMV semble utiliser dCD150, mais dans une bien moindre mesure que bCD150.

a, b, les cellules Vero-hCD150, Vero-dCD150, Vero-bCD150 et Vero ont été infectées avec rMBaMV-EGFP (MOI 0,01). La réplication et la propagation du virus ont été surveillées par cytométrie d'imagerie (a) et le titre du virus dans le surnageant (b). En a, de grandes syncytia étaient évidentes dans les cellules Vero-bCD150 par 2 dpi En b, le surnageant a été collecté tous les jours et le titre de virus a été déterminé par un test de plaque GFP (Méthodes). Les données présentées sont la moyenne ± écart-type d'expériences en triple. c–e, les cellules H441 et A549 ont été infectées avec rMBaMV-EGFP à un MOI faible (0,01) ou élevé (0,5), avec la réplication et la propagation du virus surveillées comme dans a et b : cellules H441 et A549 infectées à 1, 2 et 5 dpi (D1, D2 et D5) (c); courbes de croissance du virus représentées par les titres quotidiens dans les conditions indiquées, où les données présentées sont des titres moyens ± écart-type à partir d'infections en triple (d) ; l'aire empirique sous la courbe (eAUC) a été obtenue à partir de chaque courbe de croissance et tracée sous forme de graphique à barres à partir de trois expériences indépendantes (moyenne ± sd) (PRISM v 9.0) (e). Les barres en pointillés représentent les courbes de croissance réalisées à un MOI de 0,1 et les barres pleines à un MOI de 0,5. Les valeurs P ajustées sont indiquées (test de comparaison multiple T3 ANOVA Dunnett unidirectionnel). f, g, des cellules Vero-nectine-4 humaine (Vero-hN4) ont été infectées avec MBaMV et MeV (MOI 0,01) : MBaMV a infecté Vero-hN4 à J1, J2 et J4 (f) ; titres de virus réplicatifs pour MBaMV et MeV sur des cellules Vero-hN4 sur 5 jours (moyenne ± écart-type, n = 3) (g). Les barres d'échelle dans a, c et f sont égales à 1 mm. Toutes les images présentées sont capturées par un cytomètre d'imagerie Celigo (Nexcelom). Les images sont des composites informatiques à partir d'un nombre identique de champs dans chaque puits. La limite de détection pour la détermination du titre viral est de 20 PFU ml-1 et est indiquée par la ligne pointillée en b, d et g.

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MeV utilise la nectine-4 humaine comme récepteur de cellule épithéliale25,26, qui assure l'excrétion efficace du virus de l'hôte affecté16,27. Le CDV utilise également efficacement la nectine-4 humaine pour l'entrée et la croissance23. Pour tester si le MBaMV peut utiliser la nectine-4 humaine dans un contexte de cellules épithéliales, nous avons évalué la cinétique de réplication du MBaMV dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines qui expriment des niveaux élevés (H441) ou faibles (A549) de nectine-4 (réfs. 16,28 ) (Données étendues Fig. 4b). Étonnamment, MBaMV a montré une propagation efficace du virus (Fig. 3c) dans les cellules H441 et a atteint 104 PFU ml-1 à 6 dpi (Fig. 3d). En revanche, MBaMV a montré de petits foyers de GFP et un titre dix fois inférieur dans les cellules A549. La comparaison de l'aire sous la courbe (AUC) a révélé des différences significatives dans cette métrique de courbe de croissance (Fig. 3e). Cependant, MeV s'est toujours répliqué à des titres plus élevés que MBaMV dans les cellules H441 (Fig. 3d-e). Cela pourrait être dû à des facteurs hôtes spécifiques à l'espèce ou à des différences d'antagonisme IFN entre les morbillivirus humains et de chauve-souris. Ainsi, nous avons testé la croissance de MBaMV par rapport au MeV dans des cellules de nectine-4 Vero-humaine défectueuses en IFN (Vero-hN4). MBaMV et MeV se sont répliqués et se sont également bien propagés sur les cellules Vero-hN4 (Fig. 3f, g), validant la capacité de MBaMV à utiliser la nectine-4 humaine et suggérant que MBaMV pourrait ne pas être en mesure de contrecarrer les réponses immunitaires innées humaines.

Pour mieux comprendre le profil transcriptionnel de MBaMV, nous avons utilisé le séquençage d'ARN direct à lecture longue Nanopore pour séquencer les ARN messagers de cellules Vero-bCD150 infectées par MBaMV à 2 dpi (multiplicité d'infection (MOI) 0,01). Nous avons trouvé un gradient transcriptionnel 3′–5′ caractéristique où GFP> N> P> M> F> RBP> L (Extended Data Fig. 5a). Les morbillivirus ont un motif intergénique conservé (CUU) entre la fin du gène et le début du gène des gènes adjacents 'AAAA-CUU-AGG'. Ce motif intergénique n'était pas immédiatement apparent dans la longue région intergénique MF complexe du génome MBaMV assemblé. Cependant, la couverture élevée de cette région intergénique MF (transcrits de lecture M) a identifié le motif intergénique MF comme «CGU» au lieu de «CUU» (données étendues Fig. 5b).

Le gène P des morbillivirus est connu pour générer les gènes V ou W par l'insertion d'une ou deux guanines, respectivement, au niveau du motif d'édition conservé (AAAAGGG)29, qui est présent dans MBaMV. Le séquençage des amplicons du motif d'édition du gène P - à partir du même pool d'ARNm utilisé ci-dessus - a révélé que la fréquence des ARNm P, V et W est de 42,1%, 51,2% et 2,6%, respectivement (Extended Data Fig. 5c), suggérant que le principal L'antagoniste de l'IFN (V) est produit. Ce rapport d'édition P est similaire à ce qui a été trouvé dans des études antérieures30.

Nous avons ensuite évalué l'expression et le clivage de deux glycoprotéines de surface (RBP et F). La construction F étiquetée AU-1 C-terminale a montré F0 non clivée et F1 clivée (données étendues Fig. 5d). La construction RBP marquée par HA C-terminal a montré un monomère en plus des oligomères (données étendues Fig. 5e). MBaMV-RBP a montré un frottis supérieur à 110 kDa, ce qui suggère une oligomérisation. Cette oligomérisation a également été observée avec MeV-RBP mais pas avec CDV RBP, suggérant une stabilité différentielle dans les conditions de sous-réduction utilisées.

Les deux sous-ordres de chiroptères (chauves-souris), Pteropodiformes (Yinpterochioptera) et Vespertilioniformes (Yangochiroptera), comprennent plus de 1 400 espèces regroupées respectivement en 6 et 14 familles31. Les chauves-souris Myotis appartiennent à la famille prototypique des Vespertilionidae qui est l'homonyme de son sous-ordre. Les chauves-souris frugivores jamaïcaines (Artibeus jamaicensis) appartiennent au même sous-ordre que les chauves-souris myotis, bien qu'elles appartiennent à une famille différente (Phyllostomidae). Nous avons inoculé six chauves-souris frugivores jamaïcaines disponibles dans une colonie captive via deux voies différentes avec MBaMV pour évaluer sa pathogénicité in vivo. Toutes les chauves-souris sont restées asymptomatiques et n'ont montré aucun signe de développement d'une maladie systémique jusqu'à 3 semaines après l'infection. Nous n'avons pas non plus pu détecter de preuve moléculaire ou sérologique d'infection productive (Extended Data Fig. 6). L'inspection des séquences de chauve-souris frugivore jamaïcaine et de myotis CD150 a révélé des différences clés dans les surfaces de contact prévues avec RBP (discutées ci-dessous), qui, selon nous, sont responsables de la restriction spécifique à l'espèce observée dans notre défi expérimental des chauves-souris frugivores jamaïcaines avec MBaMV.

Pour identifier les interactions RBP-CD150 probablement impliquées dans la détermination du tropisme de l'espèce hôte, nous avons comparé les séquences d'acides aminés sur les surfaces de contact putatives des RBP de morbillivirus et leurs récepteurs CD150 apparentés. À l'aide de PDBePISA32, nous avons identifié trois régions clés dans MeV-RBP (résidus 188–198, 498–507 et 524-556, données étendues Fig. 7a-c) occlus deux régions dans CD150 (résidus 60–92 et 119–131 de CD150, Extended Data Fig. 8) dans la structure cristalline de MeV-RBP lié à CD150 (Protein Data Bank (PDB) ID : 3ALW)33. L'alignement des régions clés des RBP de morbillivirus impliquées dans les interactions CD150 révèle des différences spécifiques au virus qui suggèrent une adaptation des RBP de morbillivirus aux récepteurs CD150 de leur hôte naturel. Plus particulièrement, MBaMV est dépourvu du motif DxD aux résidus 501–503 (505–507 en MeV) qui est présent dans tous les morbillivirus à l'exception du FeMV (Extended Data Fig. 7). Ces résidus forment de multiples ponts salins et des liaisons hydrogène qui stabilisent les interactions MeV-RBP et hCD150. Leur conservation suggère qu'ils remplissent des rôles similaires pour d'autres morbillivirus. Du côté CD150 (Extended Data Fig. 8), les résidus 70–76 et 119–126 sont les plus variables entre les espèces hôtes. Fait intéressant, la chauve-souris frugivore jamaïcaine et Myotis CD150 diffèrent considérablement dans ces régions, ce qui explique l'infection non productive que nous avons observée dans nos expériences de provocation de la chauve-souris frugivore jamaïcaine.

Les macrophages alvéolaires et les cellules T et B activées exprimant CD150 sont les cibles initiales pour l'entrée du MeV et la propagation systémique. Pour mieux évaluer le potentiel zoonotique du MBaMV, nous avons comparé la capacité des morbillivirus humains et de chauve-souris à infecter les macrophages dérivés de monocytes humains (MDM) et les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Les MDM infectés par le MeV et le MBaMV étaient clairement GFP + 24 heures après l'infection (hpi) (Fig. 4a), mais l'infection était variable entre les donneurs et même entre différents stocks viraux sur le même donneur (Fig. 4b, d). Cependant, l'infection par le MeV des MDM a été inhibée par le sCD150 alors que l'infection par le MBaMV ne l'a pas été (Fig. 4c). Les MDM avaient une expression variable de CD150 (10 à 30% de CD150 +) et aucune expression de nectine-4 (données étendues Fig. 4c), mais l'infection par le morbillivirus ne semblait pas corrélée à l'expression de CD150 (Fig. 4d). Inversement, lorsque les PBMC ont été stimulées avec la concanavaline-A et l'IL-2, seul le MeV a infecté ces cellules de manière robuste (Fig. 4e).

a, b, les MDM ont été infectés par MV323-EGFP ou MBaMV (1 × 105 UI par échantillon) et ont été soit fixés par 2 % de PFA à 24 hpi, colorés au DAPI et imagés (barres d'échelle, 200 µm) (a) soit quantifiés par cytométrie en flux (b). Le pourcentage de MDM CD68+ GFP+ provenant de six donneurs est indiqué. Les symboles ouverts et barrés indiquent des expériences utilisant respectivement les virus des lots 1 et 2. Les valeurs P ajustées proviennent de l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Dunnett. c, le CD150 humain soluble (sCD150) ou un CD150 Avi-tag a inhibé l'infection par le MeV mais pas le MBaMV des macrophages. Les événements GFP+ chez les témoins non traités ont été réglés sur 100 %, et l'entrée sous sCD150/CD150 Avi-tag a été normalisée par rapport aux témoins non traités. Les valeurs P ajustées proviennent de l'ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Šídák. En b et c, les données présentées sont la moyenne ± sd de plusieurs expériences (n = 7 et n = 5, respectivement) avec des valeurs individuelles également indiquées. d, Exemples de parcelles FACS à partir des données récapitulatives présentées en b pour la coloration CD150. e, les PBMC stimulés par ConA/IL-2 ont été infectés par MeV ou MBaMV (MOI de 0,1) et analysés pour l'expression de la GFP par cytométrie en flux à 24 hpi

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Les anticorps spécifiques du MeV résultant de la vaccination peuvent fournir une protection croisée contre l'infection par le CDV34. Pour évaluer si les sérums humains d'individus vaccinés au MeV pouvaient contenir des anticorps neutralisants croisés contre le MBaMV, nous avons regroupé les sérums humains réactifs au ROR et mesuré leur capacité à neutraliser le MeV, le MBaMV et le CDV dans les cellules Vero exprimant hCD150, bCD150 et dCD150. Les sérums humains ont neutralisé efficacement l'infection par le MeV et le MBaMV et, dans une moindre mesure, l'infection par le CDV (Fig. 5a, à gauche et au centre). À l'inverse, les sérums de furets infectés par le CDV ont neutralisé l'infection par le CDV bien mieux que le MeV ou le MBaMV (Fig. 5a, à droite). Les sérums des groupes ROR 1 et 2 avaient une concentration inhibitrice de 50% (IC50) plus élevée pour le MeV et le MBaMV que pour le CDV, tandis que les sérums spécifiques au CDV avaient une IC50 significativement plus élevée pour le CDV que pour le MeV ou le MBaMV (Fig. 5b). Ces résultats indiquent que les sérums humains contiennent des anticorps neutralisants croisés pour MBaMV.

a, MeV, MBaMV et CDV ont été incubés avec des dilutions en série de pools de sérums humains provenant d'individus vaccinés par le RRO (groupe 1 et groupe 2) et de sérums de furets infectés par le CDV. La capacité du virus traité au sérum à infecter les cellules Vero exprimant le récepteur approprié a été mesurée en imageant les cellules infectées à 20 hpi, en mesurant la surface des cellules GFP + et en calculant la réduction de l'infection par rapport à l'absence de contrôle de sérum. Des courbes de neutralisation ont été tracées pour chaque virus et groupe de sérums correspondant. b, les IC50 des courbes de neutralisation présentées en a ont été générées pour chaque réplique à l'aide d'un modèle d'ajustement robuste et ont été tracées. Deux expériences indépendantes ont été réalisées avec la neutralisation des sérums humains regroupés, et une expérience avec des doublons techniques a été réalisée en utilisant les sérums CDV (moyenne ± écart-type). Les valeurs P ont été calculées avec une ANOVA unidirectionnelle en utilisant le test de comparaisons multiples de Tukey. NS, non significatif.

Données source

Les protéines MeV P et V interfèrent avec le système immunitaire inné en perturbant la voie IFN. Nos résultats de séquençage ont montré que l'infection par MBaMV produisait les transcrits P et V (Extended Data Fig. 5c), nous avons donc cherché à déterminer si les protéines MBaMV P et V pouvaient s'opposer à la voie IFN humaine. Nous avons constaté que les cellules transfectées avec MBaMV P ou V et traitées avec l'IFN ne bloquaient pas l'induction de l'élément de réponse stimulant l'interféron (ISRE), contrairement au ZIKV NS5, qui contrecarre efficacement l'ISRE (Extended Data Fig. 9a). De plus, les cellules transfectées avec MBaMV P ou V n'ont pas bloqué l'induction de l'IFN lorsqu'elles ont été traitées avec RIG-I, MDA5 ou MAVS (Extended Data Fig. 9b – d). Ces données démontrent que les protéines MBaMV P et V ne peuvent pas s'opposer à la voie de l'IFN humain.

Les traitements médicamenteux potentiels sont un problème critique pour les virus émergents. Ainsi, nous avons testé si MBaMV est sensible aux médicaments actuellement disponibles. Nous avons développé deux petits composés biodisponibles par voie orale ciblant la protéine L des morbillivirus, GHP-88309 (réf. 35) et ERDRP-0519 (réf. 36). Les différences entre MeV et MBaMV dans les cinq domaines fonctionnels de la protéine L sont présentées schématiquement sur la figure 6a37. La modélisation in silico (Fig. 6b) prédit que les deux médicaments devraient se lier de manière similaire aux protéines MeV et MBaMV L. Une inspection plus approfondie de la poche de liaison ERDRP-0519 (Fig. 6c) montre que les résidus 1155–1158 YGLE et H1288 interagissent avec ERDRP-0519. Ces résidus interagissent directement avec ERDRP-0519 dans MeV L38. La modélisation de la poche de liaison GHP-88309 (Fig. 6d) révèle l'implication des résidus E863, S869, Y942, I1009 et Y1105, qui étaient précédemment signalés comme mutants d'échappement de GHP-88309 dans MeV35. Comme prévu, les deux médicaments ont inhibé la croissance du MBaMV de manière dose-dépendante (Figs. 6e, f). Bien que la concentration efficace demi-maximale (CE50) du GHP-88309 soit inférieure pour le MeV au MBaMV (0,6 µM et 3,0 µM, respectivement), le GHP-88309 atteint une concentration plasmatique > 30 µM dans les modèles animaux, ce qui indique que ce médicament pourrait être un inhibiteur efficace du MBaMV in vivo.

a, schéma 2D de la protéine MBaMV L montrant la disposition de chaque domaine. La conservation entre la protéine MeV et MBaMV L est montrée. Les différences entre les protéines MeV et MBaMV L sont représentées par des lignes grises. b, Un modèle d'homologie 3D de la protéine MBaMV L a été généré à l'aide des coordonnées structurelles de la protéine PIV5 L (PDB ID : 6V86). L'ARN polymérase dépendante de l'ARN (RdRP), le coiffage, le connecteur, la méthyltransférase (Mtase) et les domaines C-terminal (CTD) sont colorés respectivement en bleu, vert, jaune, orange et rose. Les emplacements des meilleurs scores dans les poses d'amarrage silico pour ERDRP-0519 et GHP-88309 sont encadrés et les composés sont représentés par des bâtons rouges. c, la pose d'amarrage la mieux notée d'ERDRP-0519 dans le modèle d'homologie de la protéine MBaMV L (bâtons rouges). Une superposition de la pose d'amarrage précédemment identifiée d'ERDRP-0519 dans un modèle d'homologie de la protéine MeV L est montrée (bâtons jaunes)38. Les résidus identifiés dans les expériences précédentes de réticulation par photoaffinité (Y1155, G1156, L1157 et E1158) et H1288 du motif HR sont représentés sous forme de bâtonnets magenta. d, La pose d'amarrage la mieux notée de GHP-88309 dans le modèle d'homologie de la protéine MBaMV L (bâtons rouges). Une superposition de la pose d'amarrage précédemment identifiée de GHP-88309 dans un modèle d'homologie de la protéine MeV L est montrée (bâtons jaunes)35. Les résidus identifiés dans les études de profilage de la résistance au MeV sont représentés par des bâtons magenta. e, Les courbes de croissance d'inhibition dose-réponse de ERDRP-0519 contre MBaMV. Les cellules Vero-bCD150 ont été infectées par MBaMV à un MOI de 0, 01 pendant 1 h, puis l'inoculum a été remplacé par un milieu frais contenant un inhibiteur aux concentrations indiquées (0 à 50 µM). 2 dpi, les surnageants viraux ont été collectés et titrés sur des cellules Vero-bCD150 comme décrit dans Méthodes. Les points représentent les valeurs de trois expériences indépendantes. La courbe de régression (ligne continue) et l'intervalle de confiance (IC) à 95 % (ligne pointillée) ont été générés dans PRISM (v.8.0). f, la réponse médicamenteuse du GHP-88309 contre la croissance du MBaMV. L'inhibition du virus a été conduite de la même manière que pour ERDRP0519.

Données source

Les études de surveillance virale métagénomique assistées par le séquençage de nouvelle génération (NGS) ont permis aux scientifiques de surveiller les virus circulant dans les espèces animales et d'identifier les menaces zoonotiques potentielles5,6,7,39. La surveillance des espèces de chauves-souris a été particulièrement critique. Par exemple, plus de 60 nouvelles séquences de paramyxovirus ont été identifiées dans une étude de surveillance des chauves-souris en 2012, dont plusieurs cartographiées au genre Morbillivirus4. Des enquêtes métagénomiques récentes confirment que les chauves-souris hébergent divers orthoparamyxovirus5,6,7. Bien que la comparaison de nouvelles séquences virales avec des agents pathogènes connus puisse aider à éclairer les risques associés à de futurs événements de débordement, ce type de modélisation in silico basée sur des séquences virales devrait également être complétée par une caractérisation fonctionnelle de ces virus. Dans une étude précédente, nous avons identifié une séquence génomique complète de morbillivirus de chauves-souris M. riparius au Brésil7. Ici, nous avons généré un clone infectieux de ce virus en utilisant la génétique inverse. De plus, aucun virus recombinant n'a été détecté lors des expériences de séquençage. Avec cette approche, nous avons contourné le processus ardu d'isolement et de culture de virus vivants directement à partir d'animaux et avons plutôt produit du MBaMV en laboratoire.

Avant cette étude, il n'y avait que sept espèces de morbillivirus reconnues par le Comité international de taxonomie des virus, dont aucune n'a été isolée chez les chauves-souris. Alors que le génome MBaMV annoté s'alignait sur l'organisation classique du génome du morbillivirus (N, P/V/C, M, F, RBP et L), il était important de vérifier que le virus généré par la génétique inverse récapitulait avec succès la biologie du morbillivirus. Les tests de fusion et les expériences d'entrée ont confirmé que le MBaMV utilisait préférentiellement le CD150 du myotis par rapport au CD150 humain ou canin pour pénétrer dans les cellules Vero transgéniques (Fig. 3), ce qui correspond au paradigme selon lequel le CD150 est le principal déterminant de la spécificité de l'hôte pour les morbillivirus. Nous avons également évalué l'édition P - une caractéristique des paramyxovirus - et trouvé l'édition de l'ARN de l'ARNm P, créant de l'ARNm V (insertion G simple) ou de l'ARNm W (insertion double G) de MBaMV. Fait intéressant, la proportion d'ARNm V à 51,2 % des transcrits P totaux est inhabituellement élevée pour les orthoparamyxovirus, ressemblant davantage au virus de la peste bovine aujourd'hui éteint qu'aux morbillivirus existants40.

Chez leurs hôtes naturels, les morbillivirus sont hautement pathogènes et peuvent provoquer des infections aiguës mortelles41. Ainsi, une prédiction raisonnable est que le MBaMV provoquerait une maladie visible chez l'hôte chauve-souris. Cependant, lorsque nous avons défié des chauves-souris frugivores jamaïcaines avec MBaMV, nous avons constaté que le virus n'était pas capable de provoquer une maladie systémique chez les chauves-souris (Extended Data Fig. 6) et il n'y avait aucune preuve que MBaMV infectait ces chauves-souris de manière productive. Cette absence d'infection pourrait être due aux différences de CD150 entre les espèces - le CD150 des chauves-souris frugivores jamaïcaines et des espèces de Myotis n'est conservé qu'à 70% au niveau des acides aminés (Extended Data Fig. 8). Nous prévoyons que l'infection par le MBaMV est plus susceptible de provoquer une maladie grave chez l'espèce M. riparius. Alternativement, il est également possible que les morbillivirus de chauve-souris ne provoquent pas de maladie grave chez leurs hôtes puisque les chauves-souris possèdent des systèmes immunitaires uniques qui leur permettent d'héberger des virus mortels tels que Nipah, Ebola et le syndrome respiratoire aigu sévère sans présenter de maladie42.

Lors de l'évaluation du potentiel zoonotique d'un nouveau virus, plusieurs facteurs doivent être pris en compte, notamment l'utilisation des récepteurs, l'existence d'anticorps neutralisants croisés dans le sérum humain et les interactions avec le système immunitaire inné. Bien que les morbillivirus non humains ne soient pas actuellement connus pour franchir la barrière des espèces et infecter les humains, nous avons découvert que le MBaMV était capable d'utiliser les récepteurs humains in vitro dans une certaine mesure. Traditionnellement, les morbillivirus utilisent le CD150 pour pénétrer dans les cellules myéloïdes et lymphoïdes. Cependant, contrairement au MeV, qui infecte les macrophages humains via le CD150, le MBaMV infecte les macrophages humains de manière indépendante du CD150 (Fig. 4c)43. Ce résultat indique qu'un récepteur d'entrée non-CD150/nectine-4 pour MBaMV existe sur les macrophages humains. De plus, le MBaMV s'est bien répliqué dans les cellules H441 et dans les cellules Vero exprimant la nectine-4 humaine (Fig. 3). Le CDV utiliserait également la nectine-423 humaine et pourrait se répliquer dans les cellules H35844. Il est alarmant de constater qu'il y a eu plusieurs épidémies de CDV chez des primates non humains, entraînant une maladie aiguë ou la mort chez les animaux34. Dans une épidémie, des mutations ont été trouvées dans le RBP, ce qui a rendu le CDV-RBP capable d'utiliser efficacement le primate-CD150 (réf. 23). Cependant, il est peu probable que CDV s'adapte à l'homme en présence d'une immunité MeV à réaction croisée. Les sérums humains d'individus vaccinés par le ROR ont pu neutraliser l'infection par le MBaMV in vitro (Fig. 5) - cela limiterait probablement l'infection par le MBaMV si des humains vaccinés par le ROR étaient exposés au virus. Enfin, alors que les protéines MeV P et V antagonisent la réponse immunitaire innée, MBaMV P et V étaient incapables de bloquer l'induction ou la signalisation de l'IFN (Extended Data Fig. 9). Pris ensemble, nos résultats suggèrent que le potentiel zoonotique du MBaMV est faible en raison de la neutralisation croisée des anticorps anti-MeV et de la restriction immunitaire innée. Le premier renforce la nécessité de maintenir une couverture large et élevée de la vaccination contre la rougeole même lorsque le virus a été éliminé dans les populations humaines.

L'étude animale a été réalisée en suivant le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. L'expérimentation animale a été approuvée à l'avance par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université d'État du Colorado (numéro de protocole 1090) et menée conformément aux directives de l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire, réglementations des National Institutes of Health, Université d'État du Colorado politique et les lois locales, étatiques et fédérales. Des sérums de furet hyperimmun CDV archivés ont été obtenus à partir d'expériences animales antérieures approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université d'État de Géorgie (numéro IACUC A22035).

Toutes les recherches ont été effectuées avec l'approbation du Comité institutionnel de biosécurité (numéro de protocole SPROTO202100000065 et approbations précédentes) au niveau de sécurité biologique 2+ (BSL2+). Les morbillivirus sont classés comme agents BSL2. Le présent travail ne relève pas de la réglementation Dual Use Research of Concern puisque MBaMV n'est pas répertorié comme l'un des 15 agents officiellement reconnus comme agents Dual Use Research of Concern. Aucune expérience mutagène pour améliorer le tropisme du MBaMV n'a été réalisée. Pour l'évaluation des risques, les expériences ont été réalisées de manière séquentielle afin de minimiser les risques encourus.

Tout d'abord, nous avons examiné si le RBP de MBaMV utilise le récepteur lymphoïde humain canonique (CD150), qui est le récepteur responsable de la transmission, en utilisant un test de fusion (Fig. 1b) et un test de virus pseudotypé (Fig. 1c). Ce n'est qu'après confirmation que MBaMV n'a pas utilisé de CD150 humain dans les deux tests, suggérant que les risques zoonotiques étaient faibles, que nous avons tenté de sauver le virus de pleine longueur à BSL2 +. De plus, nos expériences ont été menées selon notre mode opératoire standard, qui exige que les expériences soient interrompues si des phénotypes virulents inattendus sont observés, puis signalés à l'IBC. D'autres facteurs d'atténuation des risques comprennent l'exigence que tout le personnel ait des titres ROR positifs.

MBaMV a été identifié dans le cadre d'une précédente étude métagénomique de chauves-souris échantillonnées au Brésil et en Malaisie. Toutes les métadonnées associées à cette étude, y compris le nombre et les espèces de chauves-souris échantillonnées, se trouvent dans Wells et al.7. Le virus a été prélevé par prélèvement rectal sur une chauve-souris qui était un mâle subadulte (immature, mais indépendant) et apparemment en bonne santé. Le profilage de l'ADN mitochondrial (MW554523 et MW557650) a identifié la chauve-souris comme une myotis riveraine (M. riparius). L'ARN a été soumis à une analyse NGS et le génome viral (MW557651) a été assemblé à partir de fichiers de lecture fastq (GSE166170). La chauve-souris a été capturée par un filet japonais, puis des écouvillons oraux, rectaux et urogénitaux ont tous été prélevés pour l'extraction de l'ARN. L'acide nucléique total a été extrait à l'aide de la plate-forme Roche MagNA Pure 96 en suivant le protocole du fabricant, puis l'acide nucléique total a été traité à la DNase (DNase I ; Ambion, Life Technologies) et transcrit à l'aide de SuperScript III (Invitrogen, Life Technologies) avec des amorces hexamères aléatoires. L'ADNc a été traité avec de la RNase H avant la synthèse du second brin par le fragment de Klenow (exonucléase 3 'à 5') (New England Biolabs), puis l'ADNc double brin a été cisaillé en fragments de 200 pb en moyenne à l'aide d'un ultrasoniseur focalisé Covaris E210. L'ADNc cisaillé a été séquencé en profondeur à l'aide de la plate-forme Illumina HiSeq 2500, et les lectures ont été assemblées de novo de manière bioinformatique à l'aide de MEGAHIT v1.2.8 après des étapes de contrôle de la qualité et l'exclusion des lectures hôtes à l'aide de Bowtie2 v2.3.5 (réf. 45). Cette méthode était la même que celle précédemment publiée7.

Les séquences d'acides aminés des protéines L ont été alignées par ClustalW, puis l'histoire évolutive des protéines L a été déduite par la méthode du maximum de vraisemblance avec un test bootstrap de 1 000 répliques. Tous les processus ont été effectués dans MEGA X (réf. 46). Pour le tableau de la matrice de conservation, les séquences d'acides aminés de chaque gène ont été alignées par ClustalW, puis les conservations ont été évaluées. Les numéros d'accession utilisés pour l'alignement sont résumés dans le tableau de données étendu 2.

Cellules 293T (n° cat. ATCC CRL-3216), cellules A549 (n° cat. ATCC CCL-185), cellules Vero (n° cat. ATCC CCL-81, RRID:CVCL_0059) et cellules BSR T7/5 (RRID :CVCL_RW96) ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Thermo Fisher Scientific) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Atlanta Biologicals) à 37 °C. Des cellules NCI-H441 (ATCC cat. n° HTB-174) ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) avec 10 % de FBS. Les cellules 293T, les cellules A549 et les cellules H441 ont toutes été certifiées à l'aide du service de test d'authentification des cellules ATCC. Les cellules Vero-hCD150 (Vero-human SLAM) sont des dérivés de cellules Vero qui expriment de manière constitutive hCD150. Les cellules Vero-dCD150 sont des dérivés de cellules Vero qui expriment constitutivement HA-dCD150. Les cellules Vero-hCD15047 et les cellules Vero-dCD15048 ont été fournies par le Dr Yanagi de l'Université de Kyushu et maintenues dans du DMEM avec 10 % de FBS. Des cellules Vero-bCD150 et des cellules Vero-hN4 ont été générées comme indiqué ci-dessous et maintenues dans du DMEM avec 10 % de FBS. Les cellules CHO ont été cultivées dans du milieu DMEM/F12 (1:1) (Gibco) avec 10 % de FBS.

Nous avons cloné l'ORF de hCD150, dCD150 et bCD150 (de Myostis brandtii puisque la séquence CD150 de M. riparius est inconnue) dans le vecteur pCAGGS coupé par EcoRI (NEB) et NheI-HF (NEB). Nous avons introduit des peptides signal HA tag-linker-Igk (acides aminés correspondant à MVLQTQVFISLLLWISGAYG-YPYDVPDYA-GAQPARSP) à l'extrémité N-terminale des CD150, comme indiqué précédemment49. La séquence de hCD150, dCD150 et bCD150 provenait de NP_003028.1, NP_001003084.1 et XP_014402801.1, respectivement. Nous avons synthétisé des séquences de gènes optimisées en codons chez GeneArt Gene Synthesis (Invitrogen), générant pCAGGS-Igk-HA-hCD150, pCAGGS-Igk-HA-dCD150 et pCAGGS-Igk-HA-bCD150. Nous avons également généré pCAGGS-Igk-HA-bCD150-P2A-Puro, qui expriment en outre le gène résistant à la puromycine. Pour pCAGGS-nectine-4-P2A-puro humaine, l'ADN synthétisé par GeneArt Gene Synthesis (Invitrogen) a été cloné dans pCAGGS.

La séquence de MBaMV RBP et F ORF a été synthétisée par GenScript. Ceux-ci ont été clonés dans le vecteur pCAGGS coupé par EcoRI et NheI-HF avec l'ajout d'une étiquette HA (gène RBP) ou AU1 (gène F) à l'extrémité C-terminale, générant pCAGGS-MBaMV-RBP-HA et pCAGGS-MBaMV-F-AU1.

Pour MeV RBP et le plasmide exprimant F, nous avons amplifié la séquence RBP et F de p (+) MV323-AcGFP avec l'ajout de HA-tag et AU1-tag identiques à MBaMV-RBP et MBaMV-F, créant pCAGGS-MeV-RBP -HA et pCAGGS-MeV-F-AU1. Pour le clonage CDV RBP et F, nous avons amplifié la séquence RBP et F du plasmide pCDV-5804P avec l'ajout de HA-tag et AU1-tag, créant pCAGGS-CDV-RBP-HA et pCAGGS-CDV-F-AU1.

Plasmides codant pour le génome du MeV ; (p(+)MV323-AcGFP) et CDV ; pCDV-5804P a été gracieusement offert par le Dr Makoto Takeda50 et le Dr Veronica von Messling, respectivement51. Nous avons transféré la séquence du génome MeV dans le vecteur pEMC, en ajoutant un promoteur T7 optimal, un ribozyme à tête de marteau, et nous avons introduit une unité transcriptionnelle eGFP à la tête du génome (pEMC-IC323-eGFP), qui est rapportée dans l'étude précédente19.

Pour la génération du plasmide codant pour le génome MBaMV, nous avons synthétisé des morceaux d'ADN à 2 000–6 000 pb chez GenScript avec l'ajout d'une unité de transcription eGFP à la tête du génome (eGFP-MBaMV). Des fragments d'ADN ont été assemblés dans le vecteur pEMC un par un à l'aide du kit de clonage HD en fusion (Takara), générant pEMC-eGFP-MBaMV. Le 1,5 kb N-terminal du gène L était initialement non clonable. L'analyse de la séquence a révélé un ORF putatif de 86 acides aminés (aa) (ORF-X) dans le brin complémentaire. L'introduction de deux mutations ponctuelles dans cette région pour perturber l'ORF-X sans affecter la séquence d'acides aminés L (Extended Data Fig. 4) a finalement permis le clonage du génome complet, suggérant que l'ORF-X était probablement toxique chez les bactéries.

Pour la récupération du MBaMV recombinant, 4 × 105 cellules BSR-T7 ont été ensemencées dans des plaques à six puits. Le lendemain, les quantités indiquées (écrites ci-dessous) de construction antigénomique, de plasmides auxiliaires (-N, -P et -L de MeV), de construction T7 et de réactif LipofectamineLTX/PLUS (Invitrogen) ont été combinées dans 200 ml d'Opti-MEM (Invitrogen ). Après incubation à température ambiante pendant 30 min, le mélange ADN-Lipofectamine a été ajouté goutte à goutte sur les cellules. Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 24h. Les cellules contenant des virus P0 ont été trypsinisées et passées sur des cellules Vero-bCD150 (2,0 × 106 cellules par flacon dans un flacon de 75 cm2). Nous avons collecté le surnageant 2 jours après la superposition (virus P1) et réamplifié MBaMV dans des cellules Vero-bCD150 fraîches (> 2 flacons T1 de 75 cm2). Ces stocks de passage 2 (P2) ont été titrés, congelés en aliquotes et utilisés pour toutes les expériences.

La quantité de plasmides de la rougeole utilisés pour le sauvetage est rapportée dans notre étude précédente52 : 5 mg de construction antigénomique, 1,2 mg de T7-MeV-N, 1,2 mg de T7-MeV-P, 0,4 mg de T7-MeV-L, 3 mg d'un plasmide codant une polymérase T7 optimisée en codons, 5,8 ml de réactif PLUS et 9,3 ml de Lipofectamine LTX.

Le sauvetage de MeV a été effectué exactement de la même manière que le sauvetage de MBaMV, sauf que 5 mg de pEMC-IC323eGFP ont été utilisés pour la transfection et que des cellules Vero-hCD150 ont été utilisées pour la co-culture.

Pour MBaMV, une monocouche de cellules Vero-bCD150 dans 12 puits a été infectée par 500 ml d'échantillons dilués en série pendant 1 h, suivi d'un remplacement du milieu par de la méthylcellulose contenant du DMEM. Ensuite, 5 dpi, le nombre de plaques GFP-positives a été compté pour déterminer le titre. Pour le test sur plaque, des cellules Vero-bCD150 infectées ont été incubées sous DMEM contenant de la méthylcellulose pendant 7 jours. Les cellules ont ensuite été colorées avec 1 % de cristal violet et 1 % de rouge neutre séquentiellement. Pour le MeV, nous avons utilisé des cellules Vero-hCD150 et fixé les plaques à 4 dpi

Un total de 2,0 × 105 cellules par puits ont été ensemencées dans une plaque à 12 puits. Les cellules ont été infectées par le titre indiqué de virus (MOI 0,01 ou 0,5) pendant 1 h, suivi du remplacement du milieu frais. Les virus ont été cultivés pendant 5 jours avec un changement moyen chaque jour. Les surnageants collectés ont été utilisés pour le titrage.

Un total de 4,0 × 105 cellules VeroCCL81 ont été transfectées avec 2 mg de pCAGGS-Igk-HA-bCD150-P2A-Puro avec Lipofectamine 2000 (Invitrogen); les cellules ont été sélectionnées sous 5 mg ml-1 de puromycine (Gibco) jusqu'à ce que des colonies soient visibles. Les colonies ont été isolées indépendamment et vérifiées pour l'expression de HA en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Des cellules Vero-hN4 ont été générées en transfectant pCAGGS-nectine-4-P2A-Puro humaine dans des cellules VeroCCL81, suivies de 5 mg ml-1 de sélection de puromycine et d'isolement de clone. L'expression de surface a été vérifiée par FACS.

Un total de 6 × 106 cellules de 293T ont été ensemencées dans une boîte de 10 cm (pré-enduite de poly-l-lysine (Sigma)) 1 jour avant la transfection. Douze milligrammes de RBP plus 12 mg de plasmide codant F de MeV, CDV ou MBaMV ont été transfectés dans des cellules par PEI MAX (Polysciences). VSV-deltaG-Gluc complété par la protéine G (VSVDG-G *) ont été infectés à un MOI de 10 pendant 1 h à 8 h après la transfection du plasmide. Les cellules ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et le milieu a été maintenu avec Opti-MEM pendant 48 h. Le surnageant a été récupéré et ultracentrifugé à 30 000 g pendant 2 h, et le culot a été remis en suspension avec 100 µl de PBS53. Pour la quantification de l'entrée virale pseudotypée, des cellules CHO dans une boîte de 10 cm ont été transfectées avec 24 mg de plasmide exprimant hCD150, dCD150 ou bCD150 avec PEI MAX. Les cellules CHO ont été passées sur des plaques à 96 puits 8 h après la transfection. Les VSV pseudotypés de MeV, CDV ou MBaMV ont été utilisés pour infecter les cellules CHO. Les unités de luciférase de Renilla (RLU) ont été mesurées par le système de dosage de la luciférase de Renilla (Promega) pour quantifier l'entrée du virus pseudotype dans les cellules.

Les cellules CHO ont été ensemencées à 50 000 cellules dans une boîte à 48 puits 24 heures avant la transfection. Les cellules ont été transfectées avec 200 mg de pCAGSS-RBP-HA (de MeV/CDV/MBaMV), 200 mg de pCAGGS-F-AU1 (de MeV/CDV/MBaMV), pCAGGS-Igk-HA-CD150 (20 ng humain, 5 ng chien ou 20 ng chauve-souris) et 50 mg de pEGFP-C1 Lifeact-EGFP (acheté chez Addgene) avec 2,5 ml de polyéthylèneimine max (Polysciences). 36 h après la transfection, les cellules ont été imagées avec un cytomètre d'imagerie Celigo (Nexcelom) avec le canal GFP, et les images ont été exportées à la résolution de 5 µm par pixel. Les foyers GFP-positifs (cellule unique ou syncytia) ont été analysés par ImageJ (développé par le NIH), créant le profil des foyers GFP-positifs individuels avec des informations sur la taille.

Pour l'évaluation de la taille des syncytia, nous avons d'abord filtré les foyers GFP-positifs avec une taille ≥10 pixel2, qui est la taille médiane de la zone GFP dans le puits de MeV-F plus la transfection LifeactGFP pour exclure le bruit de fond non spécifique. Ensuite, nous avons calculé la fréquence de syncytia qui est définie comme le nombre de GFP de ≥100 pixel2 (10 fois la taille médiane des cellules individuelles)/le nombre total de GFP de ≥10 pixel2.

Un total de 50 000 cellules dans une plaque à 96 puits ont été dissociées avec 10 µM d'EDTA dans du PBS de Dulbecco, suivi d'un FBS à 2 % dans le bloc PBS de Dulbecco. Les cellules ont été traitées avec un anticorps primaire pendant 1 h à 4 °C, puis lavées et traitées par un anticorps secondaire pendant 1 h à 4 °C. Les cellules Vero-bCD150 ont été examinées avec un cytomètre en flux Guava easyCyte (Luminex) pour la détection du signal. Les cellules Vero-hN4 ont été soumises à un cytomètre en flux Attune NxT (ThermoFisher Scientific). Pour l'anticorps primaire, l'anticorps monoclonal nectine-4 de souris (clone N4.61, Millipore Sigma) et l'anticorps polyclonal de lapin HA tag (Novus Biologicals) ont tous deux été utilisés à une dilution de 1:1 000. Pour l'anticorps secondaire, l'IgG de chèvre anti-lapin H&L Alexa Fluor 647 (Abcam) et l'IgG de chèvre anti-souris H&L Alexa Fluor 647 (Abcam) ont été utilisés de manière appropriée. FlowJo a été utilisé pour analyser les données et la présentation FACS.

La production et la purification de CD150 soluble est comme précédemment rapporté54. Le CD150 soluble est une chimère comprenant les domaines V humain (T25 à Y138) et C2 de souris (E140 à E239) + His6-tag, qui a été cloné dans le vecteur pCA7. Le plasmide d'expression a été transfecté en utilisant de la polyéthylèneimine, avec le plasmide codant pour l'antigène SV40 large T, dans des cellules HEK293S confluentes à 90 % dépourvues d'activité N-acétylglucosaminyltransférase I (GnTI). Les cellules ont été cultivées dans du DMEM (MP Biomedicals), additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FCS) (Invitrogen), de l-glutamine et d'acides aminés non essentiels (Gibco). La concentration de FCS a été abaissée à 2 % après la transfection. La protéine marquée His6 a été purifiée 4 jours après la transfection à partir du milieu de culture en utilisant la colonne d'affinité Ni2+-NTA et la chromatographie de filtration sur gel Superdex 200 GL 10/300 (Amersham Biosciences). Le pH de tous les tampons a été ajusté à 8,0. L'avitag de fusion CD150 Fc soluble a été acheté auprès de BPS Bioscience et reconstitué par PBS.

Les monocytes CD14+ ont été isolés à partir de leucopaks achetés auprès de la New York Blood Bank à l'aide du kit de sélection positive EasySep Human CD14 (StemCell #17858). Pour la différenciation des macrophages, des monocytes CD14+ ont été ensemencés à 106 cellules ml−1 et cultivés dans du milieu R10 (RPMI additionné de FBS, HEPES, l-glutamine et pénicilline–streptomycine) avec 50 ng ml−1 de facteur de stimulation des colonies de granulocytes–macrophages ( Sigma Aldrich G5035) dans un incubateur à 37 °C. Les milieux et les cytokines ont été remplacés 3 jours après l'ensemencement. 6 jours après l'ensemencement, les macrophages ont été infectés par le MeV ou le MBaMV à 100 000 unités infectieuses (UI) pour 500 000 cellules et ont été spinoculés à 300 g pendant 1 h à température ambiante. L'inoculum viral a été retiré et les cellules ont été incubées dans du milieu R10 avec un facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages à 37 ° C. Pour les expériences d'imagerie, les macrophages ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 30 hpi et colorés avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), et des images fluorescentes et en champ clair ont été capturées sur le lecteur de plaques Cytation 3. Pour les expériences de cytométrie en flux, les macrophages infectés ont été colorés pour la viabilité à 24 hpi (kit de coloration fixable LIVE/DEAD d'Invitrogen L34976), traités avec un bloc Fc humain (BD Biosciences), colorés avec des anticorps contre CD14 (clone eBioscience 61d3 ; dilution 1:100 ) et HLA-DR (clone eBioscience LN3 ; dilution 1:75), fixés dans 2 % de PFA, perméabilisés avec de la saponine et colorés pour CD68 intracellulaire (clone eBioscience Y1/82A ; dilution 1:100) et CD150 (eBioscience ; 1:75 dilution). Le CD150 soluble (1 mg ml-1) ou le CD150 Avi-tag (BPS Bioscience) ont été incubés avec du MeV ou du MBaMV pendant 15 min avant l'infection pour des expériences d'inhibition. Les macrophages colorés ont été passés dans un cytomètre en flux Attune NxT et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo (v10).

Les PBMC ont été isolés à partir de dons de sang frais obtenus par le biais du New York Blood Center en utilisant une centrifugation de densité et un gradient de ficoll. Les PBMC isolés ont ensuite été remis en suspension dans du milieu RPMI (10% FBS, 1% l-glutamine et 1% pénicilline – streptomycine) et ont été stimulés pour l'activation des lymphocytes T avec la concanavaline-A (ConA) à 5 µg ml-1 pendant 72 h. Ensuite, les cellules ont été lavées une fois avec du PBS et stimulées avec 10 ng ml-1 d'IL2 pendant 48 h. Les cellules ont ensuite été infectées à un MOI de 0, 2 avec MeV ou BaMV ou ont été infectées de manière fictive dans des plaques à 12 puits à 106 cellules ml-1. Les cellules ont été collectées 24 hpi, colorées avec le colorant rouge lointain pour cellules mortes fixables LIVE / DEAD d'Invitrogen conformément au protocole du fabricant, et analysées pour l'expression de l'eGFP par cytométrie en flux avec un cytomètre en flux Attune NxT. L'analyse a été effectuée à l'aide de FCSExpress-7. Au total, deux donneurs ont été utilisés pour cette analyse, les données du donneur 1 étant présentées à la Fig. 4.

Un total de 1 × 106 cellules 293T ont été ensemencées sur une plaque à six puits recouverte de collagène. Les cellules 293T ont été transfectées par 2 mg de pCAGGS, pCAGGS-MBaMV-RBP-HA ou pCAGGS-MBaMV-F-AU1 en utilisant de la polyéthylèneimine max (Polysciences). Les cellules ont été lavées avec du PBS, puis lysées par du tampon RIPA. Les protéines cytosoliques collectées ont été passées sur un gel de polyacrylamide à 4–15% (Bio-Rad, # 4561086) et transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (Fisher Scientific, # 45-004-113), suivies d'une réaction d'anticorps primaire et d'une réaction d'anticorps secondaire. L'anticorps polyclonal de lapin HA tag (Novus Biologicals, #NB600-363; dilution 1:1 000) et l'anticorps polyclonal AU1 épitope de lapin (Novus Biologicals, #NB600-453; dilution 1:1 000) ont été utilisés pour l'anticorps primaire pour la détection des étiquettes HA et AU1 , respectivement. L'anticorps monoclonal de lapin (Cell Signaling Technology, #2118; dilution 1:1 000) a été choisi comme anticorps primaire pour détecter la GAPDH. L'anticorps anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 647 (Invitrogen, #A-21245; dilution 1: 2 000) a été utilisé comme anticorps secondaire de manière appropriée. La capture d'image a été réalisée par Chemidoc MP (Bio-Rad).

Un total de 4,0 × 105 cellules Vero-bCD150 ont été infectées par MBaMV à un MOI de 0,01. L'ARN cytosolique a été collecté par 500 ml de TRIzol (Ambion) à 2 dpi L'ARN cytosolique collecté a été séquencé par séquence d'ARN directe par MinION (Oxford Nanopore Technologies) avec quelques modifications dans le protocole. Tout d'abord, nous avons commencé la préparation de la bibliothèque à partir de 3 mg d'ARN. Deuxièmement, nous avons utilisé SuperScript IV (Invitrogen) au lieu de SuperScript III. Le séquençage a été exécuté pendant 48 h en utilisant des Flow Cells R9.4. Le fichier fastq a été aligné sur la séquence du génome MBaMV par minimap2, et les informations de couverture ont été extraites par IGVtools.

L'infection et l'extraction d'ARN étaient les mêmes que ci-dessus (analyse du transcriptome). Un microgramme d'ARN a été rétrotranscrit par TetroRT (Bioline) avec une amorce poly-A, suivi d'une PCR avec un ensemble d'amorces de Pedit-f (séquence GGGACCTGTTGCCCGTTTTA) et Pedit-r (séquence TGTCGGACCTCTTACTACTAGACT). Les amplicons ont été traités à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ADN NEBNext Ultra conformément aux recommandations du fabricant (Illumina) et séquencés par Illumina MiSeq sur une configuration d'extrémités appariées 2 × 250 chez GENEWIZ. L'appel de base a été effectué par le logiciel de contrôle Illumina (HCS) sur l'instrument Illumina. Les fichiers fastq appariés ont été fusionnés par BBTools. Ces fichiers fastq fusionnés ont été alignés sur la séquence de référence à l'aide de bowtie2, créant un fichier SAM, et nous avons compté le nombre d'inserts d'édition P.

Des cellules Vero-hCD150, Vero-dCD150 et Vero bCD150 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits. Deux groupes de sérums humains regroupés provenant de personnes ayant déjà reçu le vaccin ROR (trois individus par pool) et de sérums de furets vaccinés avec CDV (avec la permission de Richard Plemper) ont été inactivés par la chaleur pendant 30 min à 56 °C. Des quantités égales de CDV, MeV et MBaMV (20 000 UI ml-1) ont été incubées avec des dilutions en série des sérums inactivés par la chaleur pendant 15 min à température ambiante. Le virus et les sérums ont ensuite été ajoutés aux cellules Vero avec le bon récepteur et placés à 37°C. A 20 hpi, les cellules ont été imagées à l'aide d'un cytomètre d'imagerie Celigo (Nexelcom) avec le canal GFP. Les images exportées ont été analysées à l'aide d'ImageJ pour mesurer l'étendue de l'infection virale par zone GFP+ (MeV et MBaMV) ou le nombre total de GPF+ (CDV). Le pourcentage de réduction de l'infection a été calculé en fixant le niveau d'infection dans les puits témoins sans sérum à 100 %. Les données normalisées ont été tracées à l'aide de GraphPad Prism et les courbes de neutralisation ont été générées à l'aide d'une régression non linéaire avec la concentration d'inhibiteur par rapport à la réponse normalisée. Les valeurs IC50 ont été calculées pour chaque répétition à l'aide d'un modèle d'ajustement robuste. Cinq répétitions ont été réalisées pour la neutralisation du MeV et du MBaMV avec les sérums humains regroupés, et deux répétitions ont été répétées avec le CDV et les sérums de furet.

Les furets ont été vaccinés avec CDV, et le sérum a été collecté et regroupé à partir de trois furets femelles. Ce sérum a été utilisé dans des essais de neutralisation virale. Bien que ces sérums d'archives aient été obtenus dans le cadre d'études approuvées par l'IACUC (protocole IACUC A22035), les travaux n'ont pas été publiés ailleurs. Les furets ont été gardés au niveau 1 de biosécurité animale dans un environnement d'hébergement groupé en cage ouverte à 20 ° C (40% d'humidité relative) avec des changements de cage hebdomadaires, de la nourriture (régime formulé par Marshall Farms) et de l'eau à volonté, et une photopériode de 14 h de lumière et 10 h d'obscurité. Ces furets ont été immunisés par le vendeur (fermes Triple F) et ont été vaccinés (par voie sous-cutanée) à l'âge de 10 semaines à l'aide d'un vaccin CDV à vecteur d'ADN canarypox ribosomal, Purevax Ferret Distemper, conformément au protocole du fabricant (prime plus deux doses supplémentaires à 3 semaines intervalles). Les furets immunisés ont été saignés à l'âge de 8 mois. Après qu'une seule prise de sang de 2 ml ait été prélevée dans la veine jugulaire, les furets ont été retirés sans effets indésirables.

Les chauves-souris frugivores jamaïcaines proviennent de la colonie de reproduction de l'Université d'État du Colorado qui a été créée à partir de chauves-souris de zoo données en 2006. Il s'agit d'une colonie de vol libre et les femelles reproductrices produisent une progéniture à des intervalles d'environ 5 à 6 mois. Les chauves-souris sont nourries quotidiennement avec des fruits frais (cantaloup, pastèque et banane) complétés par des biscuits pour singe et des aliments pour oiseaux contenant du fer comme sources supplémentaires de protéines et de calories. Pour le défi expérimental avec le virus, les chauves-souris ont été logées dans une cage à oiseaux (76h × 56w × 56d cm) qui permettait une extension complète des ailes et des mouvements. Le tissu paysager est couramment utilisé comme substrat de repos dans les cages. Les chauves-souris ont été maintenues sous une photopériode de 12/12 h avec une température ambiante maintenue à 22 °C et une humidité relative allant de 35 % à 50 %. Les chauves-souris ont été tuées par inhalation d'isoflurane à 3 %, suivie d'une thoracotomie.

Pour les tests d'induction de gènes stimulant l'interféron, des cellules HEK 293T ont été transfectées avec des plasmides codant pour ISG54-ISRE-FLuc, TK-RLuc et soit un vecteur vide, MBaMV P, MVAMV V ou ZIKV MR766 NS5. A 24h post-transfection, les cellules sont traitées avec 100 U d'IFNb humain (à 100 U ml-1). Les cellules ont été lysées 24 h après le traitement à l'IFNb et l'expression de FLuc et RLuc a été mesurée à l'aide du test Promega Dual luciférase. Les données ont été calculées sous la forme d'un rapport Fluc:RLuc pour normaliser l'efficacité de la transfection. Deux expériences indépendantes avec trois répétitions techniques ont été réalisées. Pour mesurer l'antagonisme de l'induction de l'IFN (activation du promoteur de l'IFNb), des cellules HEK 293T ont été transfectées avec des plasmides codant pour l'IFNb-FLuc, TK-RLuc un stimulant du promoteur de l'IFN (soit RIG-I, MDA5 ou MAVS), et un vecteur vide, MBaMV P , MBaMV V ou HCV NS3/4A (antagonistes potentiels de l'IFN). 24 h après la transfection, les cellules ont été lysées et l'expression de FLuc et RLuc a été mesurée par le test Promega Dual luciférase. Les données ont été calculées sous la forme d'un rapport Fluc:RLuc pour normaliser l'efficacité de la transfection. Deux expériences indépendantes avec trois répétitions techniques ont été réalisées. Pour l'analyse statistique, une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec des comparaisons multiples de Dunnett a été réalisée avec Prism.

Six chauves-souris frugivores jamaïcaines mâles adultes (Artibeus jamaicensis) ont été inoculées avec 2 × 105 PFU MBaMV-eGFP ; trois chauves-souris ont été inoculées par voie intranasale et trois chauves-souris ont été inoculées par voie intrapéritonéale. Une semaine après l'inoculation du virus, les chauves-souris ont été soumises à une collecte de sang et de sérum, inspectées visuellement pour l'expression de la GFP autour des narines, de la cavité buccale et des yeux par caméra LED dans chaque groupe (par voie intranasale et intrapéritonéale) tout en étant hébergées dans des cages à oiseaux. Deux semaines après l'infection virale, du sang, du sérum et des tissus (poumon, rate et foie) ont été prélevés sur une chauve-souris de chaque groupe. Trois semaines après l'infection virale, du sang, du sérum et des tissus (poumon, rate et foie) ont été prélevés sur une chauve-souris de chaque groupe. Au moment de la collecte des échantillons, les chauves-souris ont été tuées et leurs tissus traités. Les chauves-souris provenaient de la colonie de reproduction de la Colorado State University et y étaient hébergées.

L'ARN sanguin a été extrait par TRIzol. L'ARN a été rétrotranscrit par le kit de synthèse d'ADNc Tetro (Bioline) avec l'amorce de 'GAGCAAAGACCCCAACGAGA' ciblant le génome MBaMV-GFP, puis le nombre de génomes a été quantifié par le kit SensiFAST SYBR & Fluorescein (Bioline) et le système de détection PCR en temps réel CFX96 Touch (Bio-Rad). L'ensemble d'amorces pour qPCR est 'GGGGTGCTATCAGAGGCATC' et 'TAGGACCCTTGGTACCGGAG'.

Le test de neutralisation du virus a été effectué comme suit. Le sérum de chauve-souris inactivé par la chaleur (56 ° C × 30 min) a été dilué en série trois fois (à partir d'une dilution cinq fois) et mélangé avec 2 × 104 PFU ml-1 de MBaMV à un rapport 1: 1 pendant 10 min à température ambiante . Cent millilitres de mélange ont été appliqués sur des cellules Vero-batCD150 dans 96 puits. Les foyers de GFP ont été détectés et comptés par le cytomètre d'imagerie Celigo (Nexcelom). Les comptages de GFP des échantillons traités avec du sérum ont été normalisés par un puits sans sérum.

Les tissus ont été fixés avec du formol tamponné à 10 % et inclus avec de la paraffine, puis tranchés finement. L'immunohistochimie GFP a été réalisée à l'aide de VENTANA DISCOVERY ULTRA. Un anticorps monoclonal de lapin (Cell Signaling Technology, #2956) a été utilisé comme anticorps primaire, et OMNIMap anti-lapin-HRP (Roche, #760-4310) a été utilisé comme anticorps secondaire. Le signal GFP a été visualisé en utilisant le kit Discovery ChromoMap DAB (Roche, #760-2513). Les tissus ont été contre-colorés avec de l'hématoxyline pour visualiser les noyaux. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille des échantillons, mais nos tailles d'échantillon sont similaires à celles publiées précédemment. La collecte et l'analyse des données n'ont pas été effectuées en aveugle aux conditions des expériences.

L'amarrage in silico a été réalisé avec MOE 2018.1001 (Chemical Computing Group), comme décrit précédemment38. Un modèle d'homologie de MBaMV L a été créé sur la base des coordonnées structurelles de PIV5-L (PDB ID : 6V86) à l'aide du serveur de modélisation d'homologie SWISS-MODEL55. Avant l'amarrage, le modèle de la protéine MBaMV L a été protoné et l'énergie minimisée. Un protocole d'ajustement induit utilisant le champ de force Amber10 a été mis en œuvre pour ancrer ERDRP-0519 et GHP-88309 dans MBaMV L. Pour la liaison de ERDRP-0519, les résidus Y1155, G1156, L1157, E1158 et H1288, et pour la liaison de GHP-88309 , les résidus E858, D863, D997, I1009 et Y1106, ont été présélectionnés comme cibles d'amarrage, qui devraient tapisser les sites d'amarrage de ERDRP-0519 et GHP-88309, respectivement, dans MeV L. Les poses d'amarrage les mieux notées ont été sélectionnées et alignées dans Pymol sur les poses d'amarrage in silico précédemment caractérisées des inhibiteurs de la protéine MeV L. L'alignement des séquences des protéines MBaMV et MeV L a été réalisé à l'aide de Clustal Omega56. La conservation a été notée à l'aide du serveur de conservation d'alignement AL2CO57,58.

Le traitement TEM de routine a été effectué comme décrit. Les cellules Vero-bCD150 infectées par MBaMV pendant 3 jours ont été lavées avec du PBS puis fixées avec du glutaraldéhyde 2,5 % dans du tampon cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,4) sur de la glace pendant 1 h. Les cellules ont été grattées de la boîte de Pétri de 100 mm traitée par culture tissulaire et culottées par centrifugation à basse vitesse (400 g pendant 5 min). Le culot a été fixé pendant 30 min avec le même fixateur avant fixation secondaire avec du tétraoxyde d'osmium à 2 % sur de la glace pendant 1 h. Les cellules ont ensuite été colorées avec une solution aqueuse d'uranyle à 2% en bloc pendant 1 h à température ambiante, déshydratées avec une série de gradients d'éthanol croissants suivis d'un traitement à l'oxyde de propylène et incorporées dans un mélange de résine Embed 812 (Electron Microscopy Sciences). Les blocs ont été durcis pendant 48 h à 65 ° C, puis découpés en sections ultrafines de 70 nm à l'aide d'un couteau diamanté sur un Leica Ultracut 6 et transférés sur des grilles en cuivre de 200 mesh. Les coupes ont été contre-colorées avec de l'acétate d'uranyle à 2 % dans de l'éthanol à 70 % pendant 3 min à température ambiante et dans du citrate de plomb pendant 3 min à température ambiante, puis examinées avec un microscope électronique à transmission JEOL JSM 1400 équipé de deux caméras CCD pour l'acquisition d'images numériques : Veleta 2K × 2K et Quemesa 11 mégapixels (EMSIS) fonctionnaient à 100 kV.

Toutes les méthodes statistiques utilisées dans l'analyse sont répertoriées dans les légendes des figures ci-jointes. Les analyses ont été calculées à l'aide de GraphPrad Prism (v10). La distribution des données était supposée normale, mais cela n'a pas été formellement testé. En ce qui concerne l'étude de provocation par les chauves-souris, aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon et aucune donnée n'a été exclue de l'analyse.

Les cellules dendritiques primaires normales et les macrophages utilisés dans ce projet provenaient du « sang périphérique humain Leukopack, frais », qui est fourni par le fournisseur commercial New York Blood Center. La leucaphérèse a été réalisée sur des donneurs normaux à l'aide de formulaires de consentement et de protocoles approuvés par le comité d'examen institutionnel par le fournisseur. Le vendeur détient les consentements des donateurs et l'autorisation légale qui devrait donner la permission pour toute utilisation de recherche. Le fournisseur n'est pas impliqué dans la conception de l'étude et n'a aucun rôle dans ce projet. Les échantillons ont été anonymisés par le vendeur et nous ont été fournis. Pour protéger la vie privée des donateurs, le fournisseur ne divulgue aucun dossier de donneur. S'il est utilisé à des fins de recherche uniquement, le consentement du donneur s'applique. Des aliquotes de sérums immuns regroupés ont été obtenues à partir d'une précédente enquête sérologique anonyme qui a été qualifiée d'exemption 4 selon les directives de recherche sur les sujets humains exemptés du NIH (Icahn School of Medicine at Mount Sinai)59. Des échantillons de sérum ont été achetés auprès d'Innovative Research en tant que réactifs de recherche anonymisés. Le sérum a été prélevé entre août et novembre 2014 dans le Michigan, auprès de donneurs âgés de 18 à 64 ans. Pour le sérum humain, les titres réactifs au MuV ont été précédemment déterminés avec un dosage immuno-enzymatique contre le MuV-F et le MuV-HN recombinants en plus des titres de neutralisation à l'aide de la souche vaccinale recombinante de MuV (JL5). Les échantillons de sérum utilisés dans cette étude provenaient de donneurs qui présentaient des titres de neutralisation supérieurs aux titres médians pour cette cohorte tels que déterminés précédemment59.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les résultats bruts NGS de la surveillance des chauves-souris, de l'édition du gène P et du transcriptome par MinION sont téléchargés sur NCBI GEO : GSE166170, GSE166158 et GSE166172, respectivement. Les images non traitées de nos expériences ont été téléchargées sur Figshare, et des liens sont disponibles dans les données sources. Les informations sur la séquence MBaMV assemblée et la séquence pEMC-MBaMVeGFP sont disponibles auprès de NCBI Genbank MW557651 et MW553715, respectivement. La séquence hôte de la cytochrome oxydase I et la séquence hôte du cytochrome b de la chauve-souris infectée par le virus sont disponibles aux adresses MW554523 et MW557650. La séquence du plasmide codant l'ADNc génomique du MeV (pEMC-IC323eGFP) est disponible sur MW401770. Les données sources sont fournies avec ce document.

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SI a été soutenu par le groupe d'étude clinique d'hématologie et d'oncologie de l'Université de Fukuoka (CHOT-SG). Cette étude a été financée en partie par les subventions NIH U19 AI171403 et AI071002 (RKP et BL), AI149033 (BL et JL), AI140442 (TS), AI134768 (TS) et USAID PREDICT (SJA, JHE, PD et ED). JCCJAA, KYO, AP et CSS reconnaissent le support de T32 AI07647. KYO était en outre pris en charge par F31 (AI154739). JAA était en outre pris en charge par F31 (HL149295). JCC était en outre pris en charge par F32 (HL158173). Ce travail a également été soutenu par le Japan Agent for Medical Research and Development (AMED) Grant 20wm0325002h (TH), JSPS KAKENHI grant number 20H03497 (TH) and Joint Usage/Research Center program of Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University (SI ). T. Yanagi de l'Université de Kyushu a aimablement fourni les cellules Vero-hCD150 et Vero-dCD150. M. Takeda (Institut national des maladies infectieuses, Tokyo, Japon) et V. von Messling (Ministère fédéral allemand de l'éducation et de la recherche, Berlin, Allemagne) ont aimablement fourni les plasmides codant pour le génome du MeV et du CDV (respectivement). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Satoshi Ikegame, Jillian C. Carmichael.

Département de microbiologie, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, États-Unis

Satoshi Ikegame, Jillian C. Carmichael, Joshua A. Acklin, Hsin-Ping Chiu, Kasopefoluwa Y. Oguntuyo, Aum R. Patel, Shreyas Kowdle, Christian S. Stevens, Jean K. Lim, Ethan C. Veit, Matthew J. Evans & Benhur Lee

Département d'écologie, d'évolution et de biologie environnementale, Columbia University, New York, NY, États-Unis

Heather Wells

Département de médecine, Division des maladies infectieuses, Weill Cornell Medicine, New York, NY, États-Unis

Robert L. Furler O'Brien

Institut des sciences biomédicales, Georgia State University, Atlanta, GA, États-Unis

Robert M. Cox et Richard K. Plemper

Center for Vector-borne Infectious Diseases Department of Microbiology, Immunology and Pathology College of Veterinary Medicine Colorado State University, Fort Collins, CO, États-Unis

Miles Eckley, Shijun Zhan et Tony Schountz

Laboratoire de virologie médicale, Institut des sciences de la vie et médicales, Université de Kyoto, Kyoto, Japon

Takao Hashiguchi

Département de microbiologie, Institut des sciences biomédicales, Université de São Paulo, São Paulo, Brésil

Edison Durigon

EcoHealth Alliance, New York, NY, États-Unis

Jonathan H. Epstein et Peter Daszak

Département de pathologie, microbiologie et immunologie, UC Davis School of Veterinary Medicine, Davis, Californie, États-Unis

Simon J.Anthony

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SI, SJA et BL ont conçu cette étude. SI a effectué un test de fusion, le sauvetage de virus, l'analyse de la croissance, le séquençage de l'ARN de l'analyse du transcriptome et la génération de lignées cellulaires écrites dans l'étude. RLFO a réalisé l'imagerie TEM. JCC, JAA, ARP et JKL ont effectué les expériences sur les macrophages et les lymphocytes T et l'analyse des données. JCC a effectué les tests de neutralisation des sérums. KYO a effectué un test d'entrée de pseudotype VSV. RMC et RKP ont fourni ERDRP-0519 et GHP-88309 en plus de la modélisation in silico de MBaMV-LH-PC évalué la production de protéines par western blot. TH a fourni des informations guidées par la structure sur la conservation de la liaison RBP et CD150 ainsi que sur le CD150 humain soluble pour le test d'inhibition. KYO et SK ont évalué l'expression de surface des récepteurs de morbillivirus. Le CSS a évalué la fréquence d'édition de l'ARNm P à partir des données NGS. TS, ME et SZ ont réalisé une expérience de défi avec les chauves-souris. ED a mené une surveillance des chauves-souris en collaboration avec JHE et PDSJA et HW a effectué une analyse NGS de la surveillance des chauves-souris et a récupéré les séquences MBaMV. MJE et ECV ont réalisé les expériences de réponse IFN et d'induction. JHE, PD et SJA ont fourni des informations sur l'écologie virale et les menaces zoonotiques. BL a supervisé cette étude. SI, JCC, SJA et BL ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Benhur Lee.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie Roberto Cattaneo, Bert Rimaand et les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Représentation schématique du génome MBaMV et de ses gènes codés. Le MBaMV-eGFP recombinant généré dans cette étude est également présenté. L'unité de transcription eGFP est représentée par « G » (boîte verte). # indique la position dans L où des mutations silencieuses ont été introduites pour empêcher l'expression de l'ORF-X putatif qui semblait toxique chez les bactéries (Extended Data Fig. 3). La barre d'échelle des nucléotides est fournie pour le contexte. b, La totalité de la séquence d'acides aminés de la protéine L a été utilisée pour construire l'arbre phylogénétique des virus représentatifs des trois principales sous-familles de Paramyxoviridae. Les séquences de la protéine L ont d'abord été alignées par clustalw, puis l'arbre phylogénétique a été généré par la méthode du maximum de vraisemblance en utilisant MEGA 10 (version 10.1.8). Les nombres à chaque nœud indiquent la fidélité par test bootstrap (1 000 fois). Le MBaMV (pointe de flèche rouge) était le plus étroitement lié au virus de la maladie de Carré canine (CDV) et au virus de la maladie de Carré phocine (PDV) jusqu'à la découverte récente du morbillivirus porcin (PoMV). L'échelle indique les substitutions par site. Les numéros d'accès pour les séquences utilisées dans cette analyse phylogénétique sont présentés dans le tableau S2.

Le pourcentage de similarité des acides aminés (% AA) des protéines MBaMV par rapport aux 7 morbillivirus établis est tracé pour visualiser le degré de conservation à travers le genre. N, M, F et L ont montré une conservation relativement élevée (50 à 80 %) pour tous les morbillivirus à l'exception du FeMV. P, V, C et RBP ont montré une conservation de 30 à 50 % pour tous les morbillivirus à l'exception du FeMV. ClustalW a été utilisé pour aligner les séquences d'acides aminés apparentées de chaque morbillivirus et le % de similarité AA a été calculé en utilisant les paramètres par défaut. Les numéros d'accession des séquences utilisées sont indiqués dans le tableau S1.

Données source

Les 1 500 premiers nt du gène L étaient réfractaires au clonage. L'inspection de la séquence du gène L a révélé un ORF putatif de 86 aa dans le brin complémentaire (-) des 1 500 premiers nt du gène L (a, séquence originale et b, ORF-X). Pour déterminer si cet ORF putatif pourrait être toxique pour les bactéries utilisées pour le clonage du génome MBaMV, nous avons effectué deux mutations qui étaient silencieuses dans l'ORF L mais qui ont aboli la ou les méthionine(s) initiatrice(s) dans cet ORF-X putatif. Les nucléotides ombrés en rouge correspondent au troisième codon de la méthionine dans l'ORF-X (a, ORF-X supprimé). Ce clone génomique MBaMV "ORF-X KO" était la construction finale qui a été sauvée. La séquence d'acides aminés de l'ORF-X est représentée en (b).

Des cellules Vero exprimant de manière stable Myotis brandtii CD150 (bCD150) et de la nectine-4 humaine ont été fabriquées comme décrit dans les méthodes. a, coloration FACS pour l'expression de surface de bCD150 marqué HA sur des cellules Vero-bCD150. L'étiquette HA a été placée immédiatement après la séquence du peptide signal. b, montre l'expression de surface de la nectine-4 humaine par FACS. Des cellules Vero parentales et des cellules H441 (épithélium des voies respiratoires inférieures humaines) ont été utilisées comme témoins négatifs et positifs pour la nectine-4 humaine, respectivement. Plus de 50 % des cellules Vero-Nectin-4 expriment des niveaux plus élevés de nectine-4 humaine que les cellules H441. c, les macrophages dérivés de monocytes ont été récoltés et colorés pour la nectine-4 humaine de surface, confirmant que les macrophages n'expriment pas la nectine-4. Des cellules Vero-Nectin-4 ont été utilisées comme contrôle positif.

Les cellules Vero-bCD150 ont été infectées avec MBaMV (MOI = 0,01) et les ARN cytosoliques collectés à 2 dpi ont été soumis à un séquençage direct d'ARN ciblant les ARNm à l'aide de la plateforme MinION (Oxford Nanopore Technology). 93 917 lectures / total 797 133 lectures sont alignées sur MBaMV. a, la couverture de lecture a montré que l'infection et la réplication de MbaMV présentaient le gradient transcriptionnel de 3 'à 5' typique des paramyxovirus. La limite de chaque unité de transcription peut également être appréciée par la forte baisse des lectures qui coïncident avec la séquence intergénique trinucléotidique. Les plages de couverture de séquençage médianes (IQR) sont 6509 (N, 5368-7465), 3640 (P, 3193-4047), 3018 (M, 2533-3656), 929 (F, 722-1096), 535 (RBP, 491- 633) et 10 (L, 5-33). b, Le graphique de couverture de lecture autour de la région intergénique MF est agrandi pour montrer le motif intergénique rare de « CGU ». Le motif intergénique entre tous les autres gènes est « CUU ». c, le séquençage de l'amplicon autour du site d'édition du gène P montre la fréquence de l'édition de l'ARNm du gène P. 51,2% des ARNm du gène P ont acquis une seule insertion «G» au site d'édition, créant l'ARNm V. Les nombres indiqués sont la moyenne de trois expériences indépendantes avec des barres d'erreur représentant SD (de) montrent l'expression des glycoprotéines de surface (RBP et F) de MBaMV, MeV et CDV par Western blot. 5 μg de plasmides d'expression (pCAGGS, pCAGGS-RBP-HA, pCAGGS-F-AU1) ont été transfectés dans 293 T dans une plaque à 6 puits. Les protéines cytosoliques ont été collectées et passées sur un gel d'acrylamide. La coloration AU1 (d) a montré la protéine F pleine longueur (F0; pointe de flèche bleue) et le produit F1 clivé (astérisque rouge). La coloration HA (e) a montré l'expression du monomère RBP (pointe de flèche bleue) autour de 60 à 70 kDa en plus de l'oligomère. COXIV a été utilisé comme contrôle de charge pour le blot. Les expériences en d) et e) ont été réalisées deux fois, avec des résultats similaires.

Données source

a, 6 chauves-souris frugivores jamaïcaines (Artibeus jamaicensis) ont été inoculées avec MBaMV (2 × 105 PFU/corps) par voie intranasale (IN) ou intrapéritonéale (IP). Le sang, le sérum et les tissus (poumon, foie et rate) ont été prélevés comme indiqué. L'expression de la GFP dans les tissus a été vérifiée par GFP-IHC. b, le culot cellulaire infecté par le MeV (témoin positif) a montré un fort signal GFP IHC. c, les tissus dérivés de chauve-souris n'ont montré aucun signal GFP. L'expérience de défi de chauve-souris a été réalisée une fois. Toutes les barres d'échelle sont réglées sur 50 µM.

Les RBP de 8 morbillivirus et d'autres paramyxovirus représentatifs (virus Sendai (SeV), virus Nipah (NiV), virus des oreillons (MuV)) ont été alignés par clustalw. Les alignements autour des résidus de contact CD150 sont présentés séparément dans (a) 180-200 aa, (b) 490-510 aa et (c) 520-560 aa. Les résidus hautement et modérément conservés dans ces régions sont ombrés en noir et gris, respectivement. Les résidus occlus à l'interface RBP-CD150 de la structure cristalline MeV-ouistiti CD150 ont été identifiés par PDBePISA et indiqués par l'ombrage de couleur pêche au-dessus de l'alignement. Les liaisons hydrogène (bleu foncé), les ponts salins (rouge), les liaisons hydrogène + pont salin (violet) dans ces régions occluses sont indiqués.

Les CD150 des 8 mammifères qui sont les hôtes naturels des morbillivirus indiqués sont alignés par clustalw. Les alignements autour des résidus de contact RBP (aa60-179) sont représentés. Les résidus hautement et modérément conservés dans ces régions sont ombrés en noir et gris, respectivement. Les résidus occlus à l'interface RBP-CD150 (PDB : 3ALZ) ont été identifiés par PDBePISA et indiqués par l'ombrage de couleur pêche au-dessus de l'alignement. Les liaisons hydrogène (bleu foncé), les ponts salins (rouge), les liaisons hydrogène + pont salin (violet) dans ces régions occluses sont indiqués. Le rendu des couleurs est identique à Extended Data Figure 7.

a) Les cellules HEK 293 T ont été co-transfectées avec un plasmide ISG54-ISRE-FLuc et MBaMV P, MBaMV V, MeV V, MeV P ou ZIKV NS5. Les cellules ont été traitées avec de l'IFNb humain et l'induction d'ISRE a été mesurée par dosage de la luciférase. Les cellules HEK 293 T ont été co-transfectées avec un plasmide IFNb-FLuc, un stimulant du promoteur IFN b) RIG-I, c) MDA5 et d) MAVS et MeV P, MeV V, MBaMV P, MBaMV V ou HCV NS3 /4 A. L'induction d'IFN a été mesurée par dosage de la luciférase dans 2 expériences indépendantes avec 3 répétitions techniques (moyenne + /- SD). Les valeurs p spécifiques (* p < 0,5 ; **** p = < 0,0001) ont été calculées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec un test de comparaisons multiples de Dunnett.

Données source

Figure de déclenchement de la cytométrie en flux.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

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Ikegame, S., Carmichael, JC, Wells, H. et al. Assemblage et caractérisation de la génétique inverse activés par la métagénomique du morbillivirus de la chauve-souris myotis. Nat Microbiol 8, 1108–1122 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01380-4

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Reçu : 09 septembre 2022

Accepté : 06 avril 2023

Publié: 04 mai 2023

Date d'émission : juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01380-4

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