Développement d'un anticorps bispécifique ciblant la MP

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 18011 (2022) Citer cet article

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Mort programmée-ligand 1 (PD-L1) et immunorécepteur des lymphocytes T avec domaines Ig et ITIM (TIGIT) sont deux cibles potentielles pour l'immunothérapie du cancer, les premières études cliniques ont montré que la thérapie combinée d'anti-PD-L1 et d'anti-TIGIT avait une efficacité synergique à la fois en termes de taux de réponse global (ORR) et de survie globale (OS). Il est rationnel de construire des anticorps bispécifiques ciblant PD-L1 et TIGIT, en plus de conserver l'efficacité de la thérapie combinée, les anticorps bispécifiques (BsAbs) peuvent fournir un nouveau mécanisme d'action, comme le pontage entre les cellules tumorales et les cellules T/NK. Ici, nous avons développé un anticorps bispécifique de type IgG1 avec une cytotoxicité optimale. Dans cette étude, nous avons étudié en profondeur 16 formats IgG-VHH avec des orientations et des longueurs de lieur variables, les résultats ont démontré que le lieur (G4S) 2 non seulement séparait correctement deux domaines de liaison, mais avait également le rendement en protéines le plus élevé. De plus, l'orientation VHH-HC a parfaitement maintenu l'activité de liaison et de cytotoxicité du domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps à chaîne lourde uniquement (VHH) et de l'immunoglobuline G (IgG). Après le traitement avec BiPT-23, la croissance tumorale a été significativement supprimée in vivo, avec plus d'infiltration de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et de cellules tueuses naturelles (NK), et une déplétion sélective des cellules T régulatrices (Tregs). BiPT-23 représente une nouvelle immunothérapie conçue pour prévenir l'hyperprogression du cancer avec un blocage de PD-1, et tue préférentiellement les cellules tumorales PD-L1+ et les Tregs TIGIT+, mais maintient les cellules immunitaires CD11b+F4/80+ dans le microenvironnement tumoral (TME).

Au cours des deux dernières décennies, les anticorps bispécifiques ont offert d'énormes opportunités pour le traitement du déficit de coagulation1 et du cancer2,3,4. 272 essais cliniques d'anticorps bispécifiques se sont déroulés de 1997 à 2020, les BsAb possédaient des centaines de formats5 et environ six mécanismes d'action6, selon le mécanisme d'action (MOA), différents formats devraient être adoptés. Cependant, tous les formats ne sont pas adaptés à la fabrication industrielle, IgG-like et BiTE se sont avérés posséder une bonne développabilité et sont protégés par des brevets7. Depuis la découverte du VHH en 19938, le VHH a attiré l'attention des instituts universitaires et des sociétés de biotechnologie. L'approbation du caplacizumab par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis en 2019 a donné un coup de pouce au VHH9. En raison de sa petite taille (15 kDa), il est commode de construire des anticorps bispécifiques avec VHH.

Parmi tous les essais cliniques, 17,28 % étaient des blocages à double point de contrôle10. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires avaient le potentiel de redéfinir l'immunothérapie contre le cancer. Récemment, il a été découvert que l'immunoglobuline des lymphocytes T et le domaine ITIM (TIGIT) étaient co-exprimés avec PD-1 sur les lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL)11, et la combinaison du blocage de PD-L1/PD-1 avec l'anti-TIGIT s'est révélée supérieure. ORR et OS par rapport à l'agent unique PD-L1/PD-1 chez les patients atteints d'un cancer PD-L1 positif (score de proportion de tumeurs [TPS] ≥ 1 %)12. Il existe plusieurs anticorps bispécifiques en cours de développement clinique en Chine ciblant PD-L1 et TIGIT13,14, cependant, aucun d'entre eux n'a été optimisé pour induire une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) et une phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP).

Dans les tumeurs, PD-L1 est exprimé à la fois sur les cellules tumorales15 et les cellules immunitaires16, et les données précliniques ont révélé que le Fc fonctionnel pouvait renforcer l'activité anti-tumorale des anticorps PD-L1 via l'ADCC contre les cellules myéloïdes immunosuppressives positives PD-L117 et cellules tumorales18. Plusieurs anticorps PD-L1 approuvés ou en essais cliniques sont des anticorps monoclonaux IgG1 à fonction effectrice19. Récemment, des chercheurs ont développé un anticorps monoclonal (mAb) anti-TIGIT, le T4, qui a provoqué une réduction significative de la fréquence des lymphocytes T régulateurs intratumoraux et activé des réponses antitumorales supplémentaires des lymphocytes T CD8+20. L'ingénierie Fc ultérieure pour améliorer la capacité d'engagement du FcγR a encore amélioré l'efficacité antitumorale20. De plus, l'interaction avec le FcγR sur les APC pourrait améliorer les réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène pour l'anti-TIGIT21. En résumé, l'interaction Fc-FcγR pour les blocages PD-L1 et TIGIT a non seulement aidé NK à épuiser les cellules tumorales et les Tregs, mais a également renforcé la communication croisée entre les cellules T et les cellules présentatrices d'antigène (APC).

Dans cette étude, nous avons systématiquement étudié la relation entre la cytotoxicité de BsAb et les formats IgG-VHH. Premièrement, nous avons construit 16 BsAbs basés sur IgG et VHH, et démontré que la connexion de VHH avec la chaîne légère d'IgG affaiblissait la paire entre HC et LC. Ensuite, nous avons confirmé que placer le VHH à l'extrémité N-terminale de la chaîne lourde maintenait la cytotoxicité du VHH parental, mais pas à l'extrémité C-terminale. Enfin, l'activité antitumorale in vivo a montré que le meilleur candidat pouvait supprimer la croissance du carcinome du côlon MC38, réduire la fréquence des cellules Treg intratumorales, augmenter les cellules NK et T et maintenir les cellules immunitaires CD11b + F4 / 80 +, y compris les CD et les macrophages. le TME.

YN035 (IgG, anti-PD-L1) et hTIGI7.6, hTIGI7.11E (VHH, anti-TIGIT) ont été précédemment développés par Oricell Therapeutics. hTIGI7.6 et hTIGI7.11E de la même séquence progénitrice de hTIGI7 avaient seulement quelques différences d'acides aminés dans CDR3. Sur la base de YN035 et hTIGI7.6, nous avons conçu 16 anticorps bispécifiques (IgG en annexe) avec différents formats et longueurs de lieur (Fig. 1). La bivalence pourrait non seulement améliorer la formation de conjugués, ce qui pourrait aider les cellules T/NK exprimant TIGIT à se rapprocher des cellules tumorales PD-L122, mais également maintenir l'activité bloquante des anticorps parentaux. La meilleure option du lieur flexible et soluble était (G4S)n, qui s'appliquait aux domaines de connexion nécessitant un certain degré de mouvement23. Le lieur le plus long était (G4S)3 qui a été calculé comme étant d'environ 5,7 nm23, plus court que la distance de la synapse immunitaire (13 nm)24. En ajustant facilement le nombre de n, le lieur a permis aux BsAbs de se replier correctement, d'obtenir le rendement le plus élevé et des activités biologiques optimales. Dans notre conception, n ≥ 4 a été évité, d'une part, (G4S)3 était suffisamment long pour séparer deux domaines de liaison25 ; d'autre part, GSG est le motif de la O-xylosylation et la quantité totale de xylosylation augmente à mesure que le nombre de motifs GSG augmente dans le lieur26.

La conception d'anticorps bispécifiques. Le vert est le VHH contre TIGIT, le bleu foncé est la chaîne lourde de l'anti-PD-L1, le marron est la chaîne légère et le noir est le lieur : (GGGGS) n, n = 0–3.

Tous les BsAbs ont été exprimés dans des cellules EXPI293 (Thermo Fisher Scientific, A14527CN), après purification avec la protéine A, l'agrégation et la dissociation des BsAbs ont été évaluées par chromatographie analytique d'exclusion de taille (SEC) (Fig. 2). Dans cet essai, les BsAbs ont été théoriquement calculés à 180 kDa, dont une IgG de 150 kDa et deux VHH de 15 kDa, le temps d'élution du monomère des BsAbs était d'environ 7,1 à 7,4 min. Aucune agrégation significative n'a été observée pour tous les BsAb. Cependant, au temps d'élution de 8,1 à 8,4 min, les formats IgG-[L]-VHH (Fig. 2I – P) avaient un petit pic (7–17%) qui peut être la chaîne lourde de BsAbs, aucune chaîne légère n'était observé dans le test SEC, car la dissociation s'est produite aux étapes d'expression ou de purification, et non au stockage. Les résultats des données ont démontré que les anticorps bispécifiques IgG-[H]-VHH étaient plus stables que les IgG-[L]-VHH, de sorte que les formats AH (Fig. 2) ont été choisis pour une analyse plus approfondie et ont construit des anticorps bispécifiques BiPT-18 contre BiPT- 25 basé sur YN035 et hTIGI7.11E.

SEC de 16 anticorps bispécifiques à une concentration de 1 mg/ml. (A–H) Les formats IgG-[H]-VHH n'ont montré aucune agrégation et aucun pic de chaîne lourde uniquement. Les formats IgG-[L]-VHH (I–P) n'avaient pas de pic d'agrégation, cependant, la connexion de VHH à la chaîne légère affaiblissait l'association de HC et LC, il y avait un petit pic au temps d'élution de 8,1 à 8,4 min.

La capacité de liaison de BiPT-18–25 a été analysée par cytométrie en flux à l'aide de PD-L1 surexprimant la lignée cellulaire 293 T, afin d'étudier l'influence de VHH sur les IgG. Ici, tous les IgG-[H]-VHH se sont liés aux cellules T PD-L1 + 293 au même niveau, à la fois en termes de concentration efficace maximale et semi-maximale (EC50) (Fig. 3A, Tableau 1). Comparé à l'anticorps parental YN035, BiPT-18-25 a montré une perte de CE50 de 1,5 à 2,0 fois, cependant, nous n'avons pas constaté de réduction d'affinité dans le test ForteBio (données non présentées). De plus, pour évaluer l'impact potentiel du VHH sur la région de liaison CD16a sur les BsAbs, nous avons effectué des tests de cytotoxicité in vitro, tous les anticorps bispécifiques, YN035, hTIGI7.11E, et la combinaison des anticorps parentaux ont été mesurés avec PD-L1+ 293 T et cellule mononucléaire du sang périphérique humain (PBMC) (Fig. 3B). Tous les groupes sauf hTIGI7.11E avaient le même niveau de cytotoxicité en termes de lyse maximale et EC50. Ces résultats ont indiqué que la fusion de VHH à la chaîne lourde n'interromprait pas la liaison de Fc à CD16a. Nous avons ensuite évalué la capacité de liaison et la cytotoxicité du bras VHH des BsAbs. Tout d'abord, une cytométrie en flux utilisant TIGIT surexprimant la lignée de cellules T 293 a été réalisée, et les résultats ont montré que BiPT-22–25 (orientation VHH-HC) maintenait l'activité de liaison de hTIGI7.11E, BiPT-18–21 (orientation HC-VHH) a montré une réduction significative de la liaison et la perte de liaison s'est intensifiée à mesure que la longueur du lieur devenait plus courte (figure 3C, tableau 1). Il y avait un encombrement stérique pour la reconnaissance de l'antigène, lorsque le VHH était fusionné à l'extrémité C-terminale de la chaîne lourde. Les mêmes résultats ont pu être observés dans le test de cytotoxicité, BiPT-18–21 a obtenu des résultats inférieurs en lyse cellulaire, par rapport à BiPT-22–25 (Fig. 3D, Tableau 1). En résumé, la longueur du lieur est critique pour la liaison et la cytotoxicité de VHH dans l'orientation HC-VHH, mais pas dans l'orientation VHH-HC. Compte tenu de l'importance de la cytotoxicité des anticorps TIGIT, les BiPT-22, 23, 24 et 25 étaient de meilleurs candidats pour un développement ultérieur.

Activités contraignantes et ADCC des IBPT. (A) La capacité de liaison au PD-L1 humain est montrée. (B) L'activité ADCC sur la lignée cellulaire 293 T surexprimant PD-L1 est montrée. (C) La capacité de liaison au TIGIT humain est montrée. (D) L'activité ADCC sur la lignée de cellules T 293 TIGIT surexprimant est montrée.

Outre l'activité biologique des BsAbs, le rendement et la stabilité de l'expression ont également été analysés, les BiPT-18–25 ont été exprimés respectivement dans 100 ml et 300 ml d'EXPI293, puis purifiés dans les mêmes conditions que les matériaux et méthodes. Les résultats ont montré que le lieur (G4S) 2 avait le rendement le plus élevé à la fois dans l'orientation HC-VHH et VHH-HC (tableau 1). Le test de stabilité n'a montré aucune différence entre les BiPT-22–25 (Fig. 4A, B), cependant, hTIGI7.11E a perdu sa capacité de demi-liaison au TIGIT à 60 ° C et les BiPT n'ont pas été altérés. Le résultat inattendu a révélé que l'IgG a aidé à stabiliser le VHH dans les BsAbs. Au contraire, la dénaturation de VHH à 70 °C a perturbé la capacité de liaison de BiPT-22–25 à PD-L1. Compte tenu de tous les résultats, BiPT-23 était le meilleur BsAb capable de lier simultanément PD-L1 et TIGIT (Fig. 4C). BiPT-23 a été choisi pour évaluer l'activité antitumorale dans le modèle murin humain TIGIT-KI C57BL/6.

Le test de stabilité de BiPT-22-25. (A) Après le défi de chauffage à des températures variables, des anticorps de 25 nM ont été incubés avec une lignée de cellules T 293 surexprimant PD-L1 pour déterminer leur capacité de liaison. (B) Après la provocation par chauffage à des températures variables, des anticorps de 25 nM ont été incubés avec une lignée de cellules T 293 surexprimant TIGIT pour déterminer leur capacité de liaison. (C) BiPT-23 pourrait lier PD-L1 et TIGIT simultanément dans le test ForteBio Octet.

Étant donné que YN035 avait la réactivation croisée entre PD-L1 humain et murin, hTIGI7.11E ne reconnaissait que le TIGIT humain, et le TIGIT humain pouvait reconnaître de manière croisée le récepteur du poliovirus de la souris (PVR)27. Nous avons utilisé la souris C57BL/6 humanisée par TIGIT et le carcinome du côlon MC38 pour évaluer l'efficacité in vivo et observer la régression tumorale dose-dépendante. 36 mg / kg de BiPT-23 ont montré une inhibition de la croissance tumorale de 53, 7% (TGItv), par rapport au groupe IgG1-Fc (Fig. 5A). L'analyse par cytométrie en flux des cellules immunitaires dans le TME a montré que les cellules T augmentaient de manière significative dans trois groupes BiPT-23 (Fig. 5E). Les lymphocytes T augmentés étaient principalement des CTL CD8 positifs (Fig. 5F), tandis que les lymphocytes Th CD4 positifs présentaient une légère baisse (Fig. 5G). Comme un rapport précédent, les cellules Treg surexprimant TIGIT réduisaient de manière significative le duo à l'activité ADCC de BiPT-23 (Fig. 5H). De plus, nous avons également détecté la fréquence d'autres cellules immunitaires PD-L1 positives, et BiPT-23 n'a pas modifié la composition du sous-ensemble myéloïde (Fig. 5C), ce qui signifie que BiPT-23 a appauvri sélectivement les cellules tumorales PD-L1+, autres que PD-L1+. cellules immunitaires, conformément à un autre rapport28. Les cellules NK ont également augmenté dans les groupes Tiragolumab et BiPT-23, bien qu'il n'y ait pas de différence statistique (Fig. 5D). En 2018, le laboratoire Zhigang Tian a découvert que le blocage du TIGIT inversait l'épuisement des cellules NK infiltrant la tumeur, augmentait la fréquence des cellules NK infiltrant la tumeur exprimant CD107a, le facteur de nécrose tumorale, l'interféron-γ et le CD226.

BiPT-23 inhibe la croissance tumorale in vivo et augmente préférentiellement les cellules NK et CTL, diminue les cellules Treg et maintient les cellules immunitaires CD11b+F4/80+ dans le TME. (A) L'activité antitumorale du BiPT-23 avec trois doses. (B) L'analyse des cellules mCD45 + en tant que fraction de cellules vivantes dans le TME est montrée. (C) L'analyse des cellules mCD11b+ F4/80+ en tant que fraction de cellules mCD45+ dans le TME est montrée. (D) L'analyse des cellules NK (CD3-NK1.1 +) en tant que fraction de cellules mCD45 + dans le TME est montrée. (E) L'analyse des cellules T (CD3 +) en tant que fraction de cellules mCD45 + dans le TME est montrée. (F) L'analyse des cellules CTL (CD4-CD8 +) en tant que fraction de cellules mCD45 + dans le TME est montrée. (G) L'analyse des cellules T auxiliaires (Th) (CD4 + CD8-) en tant que fraction de cellules mCD45 + dans le TME est montrée. (H) L'analyse des cellules Treg (CD4+FoxP3+) en tant que fraction de cellules mCD4+ dans le TME est montrée. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SEM et analysées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de Tukey par rapport à chaque groupe. (*p < 0,05, ***p < 0,001).

PD-L1 n'est pas exprimé dans la plupart des tissus normaux, à l'exception des macrophages, cependant, son expression peut être induite et maintenue par de nombreuses cytokines, en particulier l'interféron-γ30. Des niveaux élevés d'expression de PD-L1 ont été rapportés dans de nombreuses tumeurs humaines30, et lors d'une réponse immunitaire antitumorale active, PD-L1 pourrait fournir un mécanisme d'échappement tumoral31. L'expression de PD-L1 est un indicateur de mauvais pronostic pour la survie des patients32. De plus, la réponse des mAb anti-PD-L1 était plus corrélée à l'expression de PD-L1 sur les cellules immunitaires telles que les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules T, autres que tumorales. cellules33.

Avelumab, un mAb anti-PD-L1 IgG1 humain a été développé et approuvé par la FDA en 2017 pour le traitement du carcinome à cellules de Merkel. L'analyse clinique a révélé qu'Avelumab pouvait lyser les lignées cellulaires de tumeurs pulmonaires humaines, telles que H460 et H441, mais pas les PBMC autologues positifs pour PD-L1 de patients cancéreux, même le niveau d'expression de PD-L1 était similaire à celui de H46028. Il semble que le mAb anti-PD-L1 avec Fc compétent puisse fonctionner à la fois comme blocage du point de contrôle et comme tueur spécifique des cellules tumorales. En outre, selon le site Web officiel de CStone Pharmaceuticals, ils ont conservé l'ADCP d'un anticorps anti-PD-L1 approuvé (Sugemalimab), pour induire la destruction directe de la tumeur par les macrophages et améliorer la présentation de l'antigène tumoral pour une immunité antitumorale à long terme.

Dans les essais cliniques, la plupart des mAb anti-TIGIT utilisaient des IgG1-Fc, comme le Tiragolumab (Roche), le Vibostolimab (Merck) et l'Ociperlimab (BeiGene)34, un mécanisme courant était la déplétion sélective des Tregs surexprimant le TIGIT dans le microenvironnement tumoral20. Au-delà de l'ADCC/ADCP de l'IgG1-Fc, les chercheurs ont découvert que la protéine 4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques (CTLA-4) et les mAb TIGIT nécessitaient l'engagement du CD16a humain sur les APC pour une activité optimale des lymphocytes T. La stimulation in vitro des PBMC humaines a révélé que la sécrétion d'IL-2 dépendait de l'interaction CD16a-hIgG1 et que le Fc mutant DLE augmentait même la production d'IL-2. Les mAb anti-TIGIT avec Fc fonctionnel pourraient aider à former la synapse immunitaire des lymphocytes T et des APC21.

L'une des préoccupations dans le développement d'inhibiteurs de points de contrôle immunitaires est la cytotoxicité médiée par Fc, en raison de la lyse des cellules immunitaires PD-L1+ et TIGIT+. Cependant, le Fc fonctionnel pourrait également fournir un mode d'action supplémentaire d'activité anti-tumorale.

Ici, nous avons développé un anticorps bispécifique tétravalent ciblant PD-L1 et TIGIT, armé d'un Fc entièrement fonctionnel. Nous avons profité du VHH pour sélectionner le meilleur format d'anticorps bispécifique et le meilleur lieur avec une développabilité et une cytotoxicité optimales. Nous avons constaté que l'association de la chaîne lourde (HC) et de la chaîne légère (LC) était significativement affectée par l'emplacement du VHH, lorsque le site de fusion était sur la chaîne légère, quelle que soit la longueur du lieur, 7 à 17 % de poids lourds. produit de chaîne uniquement mélangé dans les BsAbs purifiés (Fig. 2I – Q). La capacité de liaison de VHH a également subi une perte dans le test de cytométrie en flux (données non présentées). La région constante de la région variable séparée par LC de la chaîne légère (VL) et VHH, le lieur le plus long (GGGGS)3 est d'environ 5,7 nm23, il n'y avait donc aucune raison pour que VHH s'apparie avec VL en cis.

Quelques rapports ont étudié la relation entre les formats BsAb et ADCC35. Les chercheurs ont déjà développé des anticorps tétravalents IgG1 à double ciblage IGF-1R-EGFR basés sur des IgG et un fragment variable à chaîne unique (scFv), ils ont découvert que la fusion scFv à l'extrémité N-terminale de HC ou LC entraînait un faible rendement en BsAbs, ce qui n'était pas le cas. observé dans notre BiPT-22–25 (Tableau 1). De plus, la fixation de scFv à l'extrémité C-terminale de HC a complètement aboli la cytotoxicité des anticorps bispécifiques, bien que l'affinité de scFv n'ait chuté que 2 fois. Dans nos formats d'orientation HC-VHH, la fusion de VHH à HC n'a fait aucune différence dans l'interaction Fc-FcγR (Fig. 3) et l'activité ADCC était positivement liée à la capacité de liaison de VHH (Fig. 4). Il semble que le meilleur site de fusion pour scFv était l'extrémité C-terminale de LC, pour VHH, l'extrémité N-terminale de HC était le meilleur choix dans notre travail.

Il existe plusieurs solutions pour stabiliser le VHH, notamment le greffage de régions déterminant la complémentarité dans des cadres stables, l'introduction de liaisons disulfures non canoniques, la mutagenèse aléatoire suivie d'une sélection rigoureuse, la mutation ponctuelle de charges négatives ou positives et les fusions génétiques36,37. Les chercheurs ont autrefois utilisé la queue acide de l'α-synucléine (ATS) comme fusion avec un anticorps à domaine unique (sdAb) dépourvu de liaison disulfure, ce qui a aidé à stabiliser le sdAb38, on pensait que l'abaissement du point isoélectrique (pI) des sdAbs pourrait augmenter leur stabilité39. Cependant, dans notre travail, nous avons constaté que la fusion de VHH au HC de YN035 améliorait les performances de liaison de VHH après le défi de chauffage (Fig. 4), les mêmes résultats peuvent également être observés dans la stabilité à long terme à 40 ° C. test (données non présentées). Le pI de YN035 a été calculé comme étant de 8,54, VHH était de 8,34, BiPTs était d'environ 8,50, VH de YN035 était de 9,20 et HC de YN035 était de 8,77, la région variable de la chaîne lourde (VH) plus VL était de 8,61, il n'y avait aucune raison pour abaisser le pI de VHH par IgG. Au contraire, d'autres rapports ont révélé que le VHH chargé positivement pouvait être plus résistant à l'agrégation37,40, ce qui coïncidait avec notre résultat.

In vivo, BiPT-23 a significativement supprimé la croissance tumorale, en améliorant l'infiltration des lymphocytes T CD8+, des cellules NK et en appauvrissant les cellules TIGIT+ Treg. Fait intéressant, BiPT-23 n'a montré aucune diminution des cellules CD11b+F4/80+, y compris les cellules dendritiques (CD) et les macrophages. L'expression de PD-L1 par les DC est un régulateur clé de l'immunité des lymphocytes T dans le cancer, la signalisation PD-1 peut restreindre les réponses des lymphocytes T lors de la présentation croisée des antigènes tumoraux par les DC41. BiPT-23 peut non seulement fonctionner comme un blocage de PD-L1 et TIGIT, mais également renforcer la diaphonie entre les cellules T exprimant TIGIT et les DC PD-L1 + FcRs +. À notre connaissance, BiPT-23 était le premier anticorps bispécifique optimisé pour l'activité ADCC et avait un potentiel de développement clinique.

À l'avenir, notre anticorps bispécifique pourrait se combiner avec des cytokines améliorant la prolifération et la fonction des NK telles que l'interleukine-2 et l'interleukine-15 pour potentialiser l'ADCC médiée par les NK contre les cellules tumorales recouvertes d'anticorps et les cellules T régulières.

La lignée de cellules T 293 a été achetée auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC).

Les PBMC ont été extraits de donneurs sains et le consentement éclairé a été obtenu de leur part.

Cette étude avec des souris a été menée par Biocytogen conformément aux directives de l'AAALAC. Cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de Biocytogen et en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. A la fin de l'expérience, les animaux ont été euthanasiés avec un excès de CO2.

Toutes les études de cet article ont été réalisées conformément aux directives ARRIVE.

Croissance soutenue d'EXPI293 à la densité de 1,6 × 106 cellules/ml avec OPM-293 CD05 Medium (OPM, 12112701), SMM293-TII (SB, RZ14JL0801) et 8 mM Gluta MAX-1 (100x) (gibco, 2085465) , incubé dans un agitateur orbital à 37 °C, ≥ 80 % d'humidité relative et 8 % de CO2, 120 tr/min. Le lendemain, les cellules EXPI293 ont atteint une densité de 3 × 106 cellules viables/ml. En utilisant OPTI-MEM (gibco 2120548) pour diluer l'ADN plasmidique et 1 mg/ml de PEI (ADN plasmidique:PEI = 1:2), inverser doucement le complexe 2 à 3 fois, incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter le PEI dilué à l'ADN plasmidique dilué, mettre le mélange à température ambiante pendant 20 min, puis transférer la solution en culture cellulaire. Après 5 jours d'incubation, centrifugation de la culture à 8000g pendant 10 min, filtration du surnageant avec un filtre 0,5 μm (cobetter, OES0423).

Allumé AKTA avant 25(GE), connecté 10 ml de colonne Mab SelctSure (GE) au système, réglé le débit à 3 ml/min, lavé la colonne avec 0,5 M NaOH et 1 × PBS l'un après l'autre jusqu'à ce que les lignes de base soient à plat, puis a fait passer l'échantillon dans la colonne. Lorsque le surnageant de l'échantillon a traversé le système de colonne, lavé la colonne avec 1 × PBS jusqu'à ce que les lignes de base soient plates, utilisé 0, 1 M Gly-HCl, pH 3, 0 pour éluer la protéine, neutralisé avec 1 M Tris – HCl. Connecté 50 ml de colonne de dessalage G-25 au système, régler le débit à 8 ml/min et laver la colonne avec 0,2 M NaOH et 1xPBS l'un après l'autre jusqu'à ce que les lignes de base soient plates. Protéine collectée, filtrée à travers un filtre de 0,22 μm (Pall, FG1375), concentration déterminée par le kit BCA Protein Assay (Thermo, UJ292598).

Allumé la chromatographie liquide haute performance (Agilent Technologies série 1200), utilisé d'abord de l'eau pure MilliQ avec un débit de 2 ml/min pour éliminer l'air dans la canalisation du système, connecté le SET-C SEC-300 (Sepax, 2F36102 ) à l'instrument après un lavage de 30 min. Ensuite, nettoyez la colonne avec de l'eau pure MilliQ à un débit de 0,5 ml/min pendant 1 h, et utilisez du PBS à un débit de 1 ml/min pendant encore une heure. Anticorps dilués à 1 mg/ml, prélever 100 μl du marqueur et des anticorps dilués dans le tube échantillon respectivement. Réglez le volume de chargement du marqueur à 6 ul, débit 1 ml/min et couru pendant 20 min, puis réglez le volume de chargement d'anticorps à 10 ul, débit 1 ml/min et couru pendant 20 min.

Après digestion et centrifugation des cellules TIGIT humaines exprimant 293 T et PD-L1 humaines exprimant 293 T, elles ont été remises en suspension dans du PBS contenant 0, 1% de BSA et des cellules 4E4 ont été ajoutées à une plaque à 96 puits, 30 μl par puits. Diluer les anticorps correspondants à 200 nM, puis les diluer 3 fois dans 11 gradients, sans ajouter d'anticorps au dernier gradient. Mélanger 30 ul de solution d'anticorps avec la suspension cellulaire et incuber à 4 ° C pendant 1 h. Lavé les cellules deux fois avec du PBS contenant 0,1 % de BSA et centrifugé à 500 g à chaque fois pendant 5 min. Dilué l'anticorps secondaire anti-humain IgG Fc-650 (abcam, numéro de catalogue : ab98593) avec du PBS contenant 0,1 % de BSA à une dilution de 1:200, ajouté 30 μl à chaque puits et incubé à 4 °C pendant 30 min. Lavé les cellules 3 fois avec du PBS contenant 0,1% de BSA. Enfin, remettre en suspension les cellules avec 30 ul de PBS contenant 0,1% de BSA, lire les données par la machine iQue et utiliser Graphpad pour créer une courbe d'ajustement à quatre paramètres pour calculer l'EC50.

BiPT-22, BiPT-23, BiPT-24, BiPT-25, YN035 et hTIGI7.11E dilués respectivement dans 100 nM avec du PBS, puis incubés à 20 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C, 90 °C pendant 1 h, ont effectué une cytométrie en flux à la concentration de 25 nM pour détecter la capacité de liaison de tous les anticorps.

La liaison à double cible du BiPT-23 a été mesurée à l'aide de BLI sur l'instrument OCTET RED384 (Sartorius). 100 nM de BiPT-23 ont été capturés pendant 200 s par un biocapteur Anti-Human Fc Capture (AHC) (Sartorius AG). Les concentrations de liaison de PD-L1 et de TIGIT étaient de 100 nM, avec 400 s de phase d'association et 800 s de phase de dissociation, suivies de 5 s de régénération en solution de glycine (pH = 1,5).

293 lignées de cellules T exprimant de manière stable à la fois TIGIT humain ou PD-L1 et la luciférase ont été construites, et les cellules cibles ont été comptées, centrifugées et remises en suspension dans un milieu "DMEM + 10% FBS", 5000 cellules par puits de cellules cibles. PBMC rincé 3 fois avec du PBS, centrifugation 500g, pendant 5 min, centrifugation 400g, pendant 5 min, centrifugation 300g, pendant 5 min, toutes les centrifugations ont été conduites à température ambiante. Les cellules effectrices ont été remises en suspension dans un milieu « DMEM + 10 % FBS », 1,75 cellules E5 par puits, et le ratio cellules efficaces et cibles était de 35 : 1. Anticorps dilués à la concentration de travail initiale : 100 nM, dilution au 1/8, 7 gradients de concentration, 50 µl/puits. Mélanger les cellules cibles, les cellules effectrices et les anticorps dans une plaque de culture cellulaire à 96 puits avec un fond blanc opaque, un puits séparé de la cellule cible a été défini comme contrôle en même temps. Après 48 h d'incubation dans un incubateur à 37 °C, le contenu de la luciférase dans la plaque a été détecté avec un lecteur Tecan. Pourcentage de lyse (%) = (puits de cellule cible n-puits d'anticorps m)/puits cible n × 100.

5 × 105 cellules MC38 remises en suspension dans du PBS ont été implantées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de souris femelles C57BL/6 humanisées par TIGIT. Lorsque le volume moyen de la tumeur a atteint 100 ± 50 mm3, les souris ont été sélectionnées en fonction du volume de la tumeur et du poids corporel. Les souris qualifiées ont été assignées au hasard à 5 groupes expérimentaux, avec 6 souris dans chaque groupe. Les souris ont été traitées avec les protéines indiquées ou l'IgG1-Fc humaine à 10 mg/kg une fois tous les 3 jours pour un total de 6 fois. Les volumes de tumeurs ont été collectés à l'aide du pied à coulisse Vernier et les volumes ont été calculés en utilisant la formule d'ellipsoïde modifiée ½ m de longueur n largeur. Après expérience, le tissu tumoral de souris a été collecté pour préparer une suspension unicellulaire, qui a été colorée avec LD-eF506 et des anticorps : anti-mCD16/32, anti-mCD45-APC/Cy7, anti-mCD3ε-PerCP/Cy5.5 , anti-mCD4-PE, anti-mCD8a-BV605, anti-mNK1.1-BV421, anti-m/hCD11b-APC, anti-mF4/80-FITC, anti-m/rFoxp3-PE/Cy7. TGITV(%) = [1 − (Ti − T0)/(Vi − V0)] × 100 % (Ti : le volume tumoral moyen du groupe de traitement le i jour de l'administration, T0 : le volume tumoral moyen du traitement groupe témoin IgG1-Fc au 0ème jour d'administration ; Vi : le volume tumoral moyen du groupe contrôle IgG1-Fc au 1er jour d'administration, V0 : le volume tumoral moyen du groupe contrôle IgG1-Fc au 0ème jour d'administration). Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± SEM et analysées à l'aide d'une ANOVA à une voie suivie du test de Tukey par rapport à chaque groupe (*p <0,05, ***p <0,001).

Toutes les données sont contenues dans l'article.

Anticorps bispécifiques

Taux de réponse global

La survie globale

Domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps à chaîne lourde uniquement

Mort programmée-ligand 1

Immunorécepteur des lymphocytes T avec domaines Ig et ITIM

Anticorps monoclonal

Lymphocytes T cytotoxiques

Tueur naturel

Cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps

Phagocytose cellulaire dépendante des anticorps

Chaîne lourde

Chaîne légère

Cellule présentatrice d'antigène

Cellule dendritique

Microenvironnement tumoral

Lymphocytes infiltrant la tumeur

Cellules T régulatrices

Ser239Asp/Ala330Leu/Ile332Glu d'IgG1-Fc

Concentration efficace demi-maximale

Immunoglobuline G

Mécanisme d'action

Administration américaine des aliments et des médicaments

Cellule mononucléaire du sang périphérique humain

Récepteur du poliovirus

Protéine 4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques

Point isoelectrique

Région variable de la chaîne lourde

Région variable de la chaîne légère

Fragment variable à chaîne unique

Cellules dendritiques

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Ces auteurs ont contribué à parts égales : Zhenwei Zhong, Mengyao Zhang, Yanan Ning et Guanchao Mao.

Département de R&D, Oricell Therapeutics, Origincell Industrial Park, No. 1227 Zhangheng Road, Pudong New District, Shanghai, 201203, Chine

Zhenwei Zhong, Yanan Ning, Xiaopei Li, Qi Deng, Xiaorui Chen, Dongliang Zuo, Xiangyu Zhao, Ermin Xie, Huajing Wang, Lina Guo et Xiaowen He

École supérieure de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai, Université de médecine et des sciences de la santé de Shanghai, Shanghai, 201203, Chine

Mengyao Zhang et Bohua Li

Département de médecine protectrice contre les agents chimiques, Faculté de médecine navale, Université de médecine navale, Shanghai, 200433, Chine

Guanchao Mao et Kai Xiao

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ZZ et XH ont conceptualisé cette étude, interprété les résultats et rédigé le manuscrit. ZZ, MZ, YN, GM, XL, QD, XC, DZ, XZ et EX ont réalisé des expériences. ZZ et HW ont préparé des chiffres. XH a supervisé l'étude. Tous les auteurs ont commenté le manuscrit.

Correspondance à Zhenwei Zhong ou Xiaowen He.

Zhenwei Zhong, Yanan Ning, Qi Deng, Xiaorui Chen, Dongliang Zuo, Ermin Xie, Huajing Wang, Lina Guo et Xiaowen He sont actuellement des employés d'Oricell Therapeutics, qui développe et commercialise des anticorps et des thérapies CAR-T.

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Réimpressions et autorisations

Zhong, Z., Zhang, M., Ning, Y. et al. Développement d'un anticorps bispécifique ciblant PD-L1 et TIGIT avec une cytotoxicité optimale. Sci Rep 12, 18011 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22975-7

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Reçu : 19 juillet 2022

Accepté : 21 octobre 2022

Publié: 26 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-22975-7

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